Wiki des méthodes de biologie moléculaire et cellulaire
Glossaire collaboratif des méthodes expérimentales de biologie moléculaire et cellulaire. Ce glossaire est réalisé par les étudiants du module "Méthodes expérimentales de biologie moléculaire et cellulaire" sous la supervision de l'équipe de Génétique Animale.
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| RA | Adipo-Clear | |
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ADIPO-CLEAR
I) Objectifs La méthode Adipo-Clear permet d’obtenir une visualisation 3D d’un dépôt adipeux entier en éliminant son contenu lipidique grâce à un processus d’éclaircissement. L’imagerie tridimensionnelle du tissu adipeux est en effet très complexe, en raison des effets d’obstruction de la lumière causés par les interactions entre les lipides et l’eau. Adipo-Clear constitue une adaptation de la méthode iDISCO/iDISCO+, spécifiquement conçue pour améliorer l’imagerie 3D des tissus adipeux. Grâce à cette approche, il devient possible d’analyser les interactions entre les projections nerveuses, le système vasculaire, les cellules immunitaires et les adipocytes au sein du dépôt adipeux (Chi et al., 2018b), d’étudier le développement du tissu adipeux (Chi et al., 2018b), ou de visualiser l’expression protéique au sein du tissu (Henriques et al., 2020).
II) Principe La méthode Adipo-Clear repose sur la délipidation du tissu adipeux à l’aide de méthanol et de dichlorométhane pour atteindre une transparence du tissu adaptée à la microscopie de fluorescence à feuille de lumière (Chi et al., 2018a).
III) Mode opératoire La méthode Adipo-Clear comprend plusieurs étapes, du prélèvement du tissu disséqué à la visualisation 3D du tissu : 1) Préparation du tissu : ➢ Prélèvement du tissu par dissection, ➢ Fixation du tissu dans une solution de formaldéhyde à 4%, ➢ Lavage du tissu trois fois avec du PBS (Phosphate-Buffered Saline), 2) Perméabilisation et délipidation : ➢ Déshydratation progressive par un gradient croissant de méthanol, ➢ Délipidation au dichlorométhane (DCM), ➢ Blocage par un gradient décroissant de méthanol, 3) Immunomarquage : ➢ Incubation avec les anticorps primaires, ➢ Incubation avec les anticorps secondaires, ➢ Lavage avec le tampon Whole mount blocking buffer, ➢ Enrobage du tissu dans de l’agarose, 4) Nettoyage et éclaircissement du tissu : ➢ Lavage par un gradient croissant de méthanol, ➢ Incubation avec du dichlorométhane, puis avec de l’éthyl cinnamate (ECI). 5) Microscopie à feuille de lumière IV) Présentation des résultats Les dépôts adipeux entiers préparés avec Adipo-Clear peuvent être visualisés en 3D pour étudier les interactions entre les cellules immunitaires et les adipocytes (figure 1).
Figure 1 : Imagerie 3D des « structures en forme de couronne » dans un dépôt de tissu adipeux blanc épididymaire préparé avec Adipo-Clear, isolé d'une souris mâle nourrie avec un régime riche en graisses pendant 16 semaines. L'échantillon a été immunomarqué pour les cellules endothéliales (rouge) et pour les macrophages (bleu).
V) Interprétation des résultats Dans un état d'obésité, le tissu adipeux devient inflammé, ce qui s'accompagne de l'infiltration de macrophages pro-inflammatoires formant des structures en « couronne » autour des adipocytes morts. Les dépôts adipeux des animaux obèses sont particulièrement difficiles à éclaircir en raison de leur grande taille et de leur teneur élevée en lipides. Cependant, la méthode Adipo-Clear permet un éclaircissement homogène de l’ensemble du tissu chargé en lipides.
VI) Intérêts et limites L'étape de délipidation élimine entièrement les lipides du tissu adipeux, facilitant ainsi le marquage immunologique sur l'ensemble du tissu et limitant la diffusion de la lumière. Cela permet une imagerie homogène, sans perte de résolution en XY. Adipo-Clear offre une visualisation tridimensionnelle des tissus adipeux, apportant une compréhension plus approfondie de leur morphologie et de leur structure par rapport aux méthodes d’histologie traditionnelles (Chi et al., 2018a). La délipidation est une étape cruciale de la méthode Adipo-Clear. Lorsqu’elle est insuffisante, elle peut entraîner des images floues, en particulier vers le centre du tissu. Par ailleurs, cette approche présente des limites pour l’imagerie de signaux denses. Lorsque des anticorps sont utilisés pour marquer des signaux denses, ils peuvent être captés par les épitopes situés à la surface de l’échantillon, empêchant ainsi l’accès aux structures internes des tissus. Pour cette même raison, l’application de la méthode Adipo-Clear sur le tissu adipeux brun reste limitée. Ce type de graisse, caractérisé par une structure dense, ne permet qu’une coloration en surface, rendant l’imagerie 3D inefficace pour visualiser l’intérieur du tissu (Chi et al., 2018a). VII) Références bibliographiques Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. (2018a). Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. J Vis Exp. (137), e58271. Chi, J., Wu, Z., Choi, C.H.J., Nguyen, L., Tegegne, S., Ackerman, S.E., Crane, A., Marchildon, F., Tessier-Lavigne, M., Cohen, P. (2018b). Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27, p226-p236. Henriques, F., Bedard, A.H., Guilherme, A., Kelly, M., Chi, J., Zhang, P., Lifshitz, L.M., Bellvé, K., Rowland, L.A., Yenilmez, B., Kumar, S., Wang, Y., Luban, J., Weinstein, L.S., Lin, J.D., Cohen, P., Czech, M.P. (2020). Single-Cell RNA Profiling Reveals Adipocyte to Macrophage Signaling Sufficient to Enhance Thermogenesis. Cell Reports. 32, 107998.
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| QM | Assay of Transposase Accessible Chromatin sequencing (ATAC-seq) | ||
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Assay of Transposase Accessible Chromatin sequencing (ATAC-seq) Objectifs La méthode de «Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing» (ATAC-seq) est utilisée afin de cartographier l’accessibilité de la chromatine, c’est à dire de détecter les régions ouvertes au sein du génome, au niveau d'une seule cellule. Cela permet notamment d’identifier la position des nucléosomes au sein des régions régulatrices et de mieux comprendre la fixation détaillée des facteurs de transcription dans ces régions (Buenrostro et al., 2015). Principe La méthode consiste dans un premier temps à lyser les cellules afin d'accéder au contenu de leurs noyaux. L’euchromatine (part non condensée de l’ADN) est ensuite fragmentée par digestion enzymatique, via une transposase de synthèse hyperactive : la Tn5. Cette dernière, de manière simultanée, fragmente l'ADN accessible et tague ces framents (tagmentation). Une fois purifiés, ces fragments peuvent alors être amplifiés et séquencés (Stevant, 2019). Mode opératoire D’abord, entre 500 et 50 000 cellules cultivées sont récoltées, puis préparées par une succession de trois centrifugations intercalées d’un rinçage et d’une lyse. Le culot obtenu contient l’ADN purifié. Ce dernier est alors incubé 30 min à 37°C en présence un mélange réactionnel de transposition contenant la transposase Tn5, à l’origine de la tagmentation. Le tout est alors purifié et peut être stocké à -20°C si nécessaire. Une fois amplifiés par PCR, les fragments sont séquencés afin d’être identifiés, permettant de savoir quels fragments d’ADN sont sous forme d’hétérochromatine ou d’euchromatine (Buenrostro et al., 2015).
Figure 1 : (A) Schéma de la préparation de la bibliothèque. (B) La transposition entraîne la fragmentation de l'ADN. Avant l'amplification, les adaptateurs doivent être complétés par une étape d'extension à 72°C. Au cours de la PCR suivante, une séquence supplémentaire est incorporée dans les adaptateurs, qui comprennent des extrémités de séquençage communes et un code-barres de séquençage (Buesnrostro et al., 2015). Présentation des résultats Les données obtenues correspondent à des pics de “reads” (fragments de séquences), dans les régions ouvertes de l’ADN. Il est en effet possible de traiter les données avec un algorithme d'analyse standard tel que proposé par ENCODE project (https://www.encodeproject.org/atac-seq/). Ce dernier s’assure de la qualité du séquençage, supprime les adaptateurs d’amplification des fragments de séquence et analyse les correspondances avec un génome de référence. Les correspondances fréquentes sont matérialisées par des pics (Stevant, 2019).
Figure 2 : Identification d’un enhancer dans le tissu primodium de l’oeil chez la drosophile avec l’ATAC-seq (Davie et al., 2015) Interprétation des résultats Pré-analyse Un contrôle de la qualité est effectué, une étape habituelle avec les méthodes de séquençage haut-débit. Un alignement avec les génomes connus, puis une vérification de cet alignement sont ensuite effectués. Analyse de base La deuxième grande étape de l'analyse des données ATAC-seq consiste à identifier les régions accessibles (également appelées pics de chromatine ouverte) et constitue la base d'une analyse avancée. Analyse avancée Cette dernière étape consiste en l’analyse différentielle et annotation des pics, l’analyse de l’enrichissement des motifs, l’analyse de l’empreinte, pour conduire à l’analyse de la position des nucléosomes. (Baek et Lee, 2020) Figure 3 : Feuille de route d’une analyse typique de données ATAC-seq (Yan et al., 2020) Intérêts et limites Un intérêt de cette méthode est le faible nombre de cellules nécessaire à la mise en place de la méthode par rapport à d’autres méthodes telles que MNase-seq, ChIP-seq ou DNase-seq (10 à 100 fois moins). Le protocole nécessite 3 h de travail pour obtenir des résultats (contre 4 jours pour les autres). De plus, la PCR peut être réalisée plus tard à partir des échantillons congelés. Un problème lié à cette méthode est l’analyse informatique des données, qui peut s’avérer fastidieuse. De plus, il y a de nombreux éléments potentiellement fonctionnels dans les régions accessibles du génome. Cela complexifie l’interprétation des données si ces éléments sont mal connus (Höllbacher et al., 2020). Références bibliographiques Buenrostro, J.D., Wu, B., Chang, H.Y., and Greenleaf, W.J. (2015). ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr. Protoc. Mol. Biol. 109:21.29.1-21.29.9. Baek S, Lee I (2020) Single-cell ATAC sequencing analysis: From data preprocessing to hypothesis generation. Computational and Structural Biotechnology Journal 18: 1429–1439 Davie K, Jacobs J, Atkins M, Potier D, Christiaens V, Halder G, Aerts S. (2015) Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genetics. 4,5 Höllbacher B, Balázs K, Heinig M, Uhlenhaut NH (2020) Seq-ing answers: Current data integration approaches to uncover mechanisms of transcriptional regulation. Computational and Structural Biotechnology Journal 18: 1330–1341 Stevant I. (2019) Traquer les régions ouvertes de l'ADN avec l'ATAC-seq. Bioinfo-fr, https://bioinfo-fr.net/traquer-les-regions-ouvertes-de-ladn-avec-latac-seq, consulté le 19/03/2022 Yan, F., Powell, D.R., Curtis, D.J. et al. (2020) From reads to insight: a hitchhiker’s guide to ATAC-seq data analysis. Genome Biol 21, 22
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B |
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| CM | BICINCHONIQUE ACID ASSAY (BCA) | |
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bicinchonique Acid Assay (BCA)
I - Objectifs La quantification protéique par l’acide bicinchonique (ou BC Assay) est une méthode qui permet de déterminer la concentration en protéines d’un échantillon par colorimétrie. L’équation de la droite donnant l’absorbance en fonction de la concentration pour chaque standard permet de calculer la concentration d’un échantillon à partir de son absorbance. Cette technique est notamment utilisée avant la réalisation d’un western blot : les échantillons sont chargés de sorte qu’ils aient la même concentration. Une BC Assay est donc réalisée afin de diluer convenablement la solution protéique à l’aide des concentrations calculées à partir des données d’absorbance.
II - Principe La méthode repose sur le fait que l’absorbance est directement proportionnelle à la concentration en protéines d’un échantillon. Or, en milieu alcalin, les ions Cu2+ sont réduits en Cu+ par les protéines de l’échantillon. Puis, l’ajout de l’acide bicinchonique permet la formation d’un complexe spécifique [Acide Bicinchonique/Cu+] qui prend une teinte violette dont le maximum d’absorption se trouve à 562 nm (Walker, 1994). Figure 1 : Réactions chimique réalisée au cours du dosage colorimétrique entre protéines, ions cuivriques et BCA (Thermo Scientific, 2009) III - Mode opératoire Tout d’abord, une gamme de dilution d’Albumine de Sérum bovin (ABS) (initialement concentré à 0.5 mg/ml dans de l’eau) est réalisée. Les standards sont les suivants :
Les différents échantillons sont déposés dans chaque puits en prenant soin de retirer les cônes entre chaque dépôt. Le facteur de dilution a été déterminé par une BCA dans laquelle il y aurait une gamme de dilution pour l’ABS et une autre pour l’échantillon en question : le facteur à prendre sera alors celui dont la couleur se situe dans la gamme de couleurs de l’ABS dans l’eau. Chaque échantillon est placé en duplicata dans les puits en prenant soin de les vortexer au préalable et de changer de cône. Une fois tous les échantillons chargés, la solution BCA est préparée en combinant la solution claire (BCA Reagent A à 4.9 ml) et la bleue (BCA reagent B à 100 μl). 200 μl de cette solution colorée sont déposés dans chacun des puits. La plaque est incubée à 37°C pendant 30 minutes, puis passée au spectrophotomètre. L’absorbance de chaque valeur permettra de déterminer la concentration de chaque échantillon à partir de l’équation de la droite d’étalonnage réalisée grâce aux standards. IV - Présentation des résultats Le lecteur de plaque (ou spectrophotomètre) donne des valeurs d’absorbance pour chaque puits. La valeur d’absorbance du standard 6 est soustraite (information background) à toutes les autres, puis la moyenne de chaque dépôt déposé en double est calculée. Ensuite, une droite est tracée en prenant en paramètre l’absorbance de chaque standard en ordonnée et leur concentration en abscisse. Puis, via l’équation de la droite, la concentration de chaque échantillon est obtenue ; une moyenne sera faite entre les duplicatas. Il ne faut évidemment pas oublier de prendre en compte la dilution effectuée au cours de l’expérience dans ses calculs.
Figure 2 : Présentation d’un résultat de BCA avec l’exemple de l’albumine de bovins (Andrew, 2018, résultats non publiés)
NB : Les résultats ne seront valables que dans la mesure où :
V - Intérêts et limites Les avantages sont la rapidité et la simplicité, puisqu’elle peut être faite en une étape (30 minutes pour déposer les échantillons et 30 minutes d’incubation à 37°C), contrairement à la méthode de Lowry (autre méthode de quantification colorimétrique), qui elle en nécessite deux (Lowry et al., 1951 et Smith et al., 1985). Cependant, des interférences peuvent venir perturber les données d’absorbance de la solution : des substances réduisant le cuivre, des acides aminés et des réactifs chélatant le cuivre (production d’un couleur, donc manque de précision de la protéine utilisée). Néanmoins, la BC Assay serait plus tolérante face à la présence de composés qui seraient susceptibles de brouiller les résultats, contrairement à la méthode Lowry (Thermo Scientific, 2009). En revanche, la fiabilité de cette méthode dépend fortement de la précision de l’utilisateur lorsqu’il réalise les dépôts et peut par conséquent manquer de précision selon la qualité des dépôts. Étant donné les réactifs utilisés, elle reste aussi coûteuse.
VI - Références bibliographiques Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, and Randall RJ. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1):265-75. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, and Klenk DC (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid, Anal.Biochem. 150 (1), 76-85 Thermo Scientific Pierce Protein Assay Technical Handbook, (2010), p.15-20 Walker J, (1994) The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. Methods Mol Biol. 32,5-8. | ||
| JB | BIOLISTIQUE | |
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La biolistique I. Objectifs La biolistique, également appelée gene gun, est une méthode de transfert de gènes direct, notamment utilisée sur les cellules végétales (Tagu et al., 2018). Des micro-projectiles propulsés à haute vitesse introduisent des gènes d’intérêts dans les cellules cibles. Cette méthode est à la fois utilisée en recherche pour étudier l’expression génétique de certains gènes (Hamad et al., 2020) par exemple, mais également pour la production de nouvelles variétés, en agriculture (Sobańska et al., 2019).
II. Principe La biolistique consiste à projeter sur des tissus des micro-projectiles enrobés d'ADN à l'aide d'un canon à particules. Certains micro-projectiles pénètrent les membranes et arrivent dans le noyau. L’ADN transporté est libéré et peut être exprimé par la cellule (Tagu et al., 2018).
III. Mode opératoire Dans un premier temps, les micro-projectiles en tungstène ou en or de 1 à 3 µm de diamètre sont enrobés avec l’ADN d’intérêt par précipitation en présence de chlorure de calcium et de spermidine, qui favorisent son adhésion à la surface des billes. Ces micro-projectiles servent ainsi de vecteur pour faire entrer le gène d’intérêt dans les cellules cibles (Tagu et al., 2018). IV. Objectifs La biolistique, également appelée gene gun, est une méthode de transfert de gènes direct, notamment utilisée sur les cellules végétales (Tagu et al., 2018). Des micro-projectiles propulsés à haute vitesse introduisent des gènes d’intérêts dans les cellules cibles. Cette méthode est à la fois utilisée en recherche pour étudier l’expression génétique de certains gènes (Hamad et al., 2020) par exemple, mais également pour la production de nouvelles variétés, en agriculture (Sobańska et al., 2019).
V. Principe La biolistique consiste à projeter sur des tissus des micro-projectiles enrobés d'ADN à l'aide d'un canon à particules. Certains micro-projectiles pénètrent les membranes et arrivent dans le noyau. L’ADN transporté est libéré et peut être exprimé par la cellule (Tagu et al., 2018).
VI. Mode opératoire Dans un premier temps, les micro-projectiles en tungstène ou en or de 1 à 3 µm de diamètre sont enrobés avec l’ADN d’intérêt par précipitation en présence de chlorure de calcium et de spermidine, qui favorisent son adhésion à la surface des billes. Ces micro-projectiles servent ainsi de vecteur pour faire entrer le gène d’intérêt dans les cellules cibles (Tagu et al., 2018). Ensuite, les micro-projectiles sont propulsés, soit suite à une explosion de la poudre contenu dans le pistolet à gènes (figure 1), soit suite à la détente d’un gaz sous pression, souvent l’hélium. Certains micro-projectiles entrent en contact avec la paroi cellulaire et ralentissent lors de leur passage à travers les différentes membranes végétales (Wellmann et al., 1999).
Figure 1 : Pistolet biolistiqueSource : https://www.shutterstock.com/fr/ Ils peuvent atteindre aussi bien le cytoplasme que le noyau. Les micro-particules arrivant dans le noyau peuvent alors libérer l’ADN transporté, permettant ainsi l’expression du gène. Notons que la durée d’expression du gène inséré est variable (Tagu et al., 2018).
VII. Présentation des résultats La biolistique est une méthode d’insertion d’un gène, mais elle ne permet pas d’évaluer immédiatement si elle a été efficace à court terme. Tout d’abord, l’utilisation de PCR ou d’un gène rapporteur permet de vérifier l’arrivée du gène dans la cellule cible (Wellmann et al., 1999). Ensuite, réaliser un Southern Blot confirme l’intégration stable du gène dans le génome hôte. Et enfin, un Western Blot ou une RTqPCR atteste l’expression du gène dans le tissu cible (Sobańska et al., 2019).
VIII. Interprétation des résultats Une des principales méthodes pour visualiser l’insertion du gène d’intérêt est l'utilisation d’un gène rapporteur.
Figure 2 : Gènes rapporteurs EGFP (A et D) et lac Z (B et C) Wellmann H et al., 1999
Wellmann et al.(1999) utilisent deux gènes rapporteurs : GFP (figure 2.A et 2.D) et la lac Z (figure 2.B et 2.C). Le gène de la Green Fluorescent Protein est ajouté avec le gène d’intérêt et code une protéine fluorescente : GFP. Sous un microscope à fluorescence, le gène de la GFP permet de s’assurer de l’insertion du gène d’intérêt. Ils utilisent également un autre gène rapporteur : lac Z. Le gène lac Z est inséré avec le gène d’intérêt et code l’enzyme β-galactosidase. En présence du substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside), la β-galactosidase le dégrade et libère un composé qui précipite en bleu. Ainsi, dans les deux cas, l’insertion et la détection du gène rapporteur permet de s’assurer de la bonne insertion du gène d’intérêt. L'utilisation d’un gène rapporteur n’est pas l’unique solution pour s’assurer de l’efficacité de l’insertion du gène d’intérêt. Pour plus d'informations sur les autres méthodes, vous pouvez vous référer aux autres méthodes du wiki.
IX. Intérêts et limites La biolistique est simple, rapide et efficace, surtout chez les végétaux. Cette méthode peut également être appliquée à tout organisme possédant un génome. Cependant, elle est souvent moins performante que d’autres méthodes comme la transformation bactérienne dans le cas des cellules animales[JF1] (Sanford, 1988). De plus, elle repose essentiellement sur le hasard. En effet, il est nécessaire que les micro-projectiles atterrissent dans le noyau pour que cela fonctionne. Rappelons que le noyau de la cellule végétale mesure en moyenne 5 à 7 µm et que les micro-projectiles mesurent entre 1 et 3 µm. Les chances qu’un micro-projectile y arrive sont minces. De plus, il faut que le micro-projectile possède encore de l’ADN non altéré lors de la projection. Et pour finir, cet ADN, s’il s’intègre dans le génome, peut s’insérer n’importe où, y compris au milieu de séquences codantes qui seront alors endommagées, ou dans des zones inactives. Sachant que de trop nombreuses copies peuvent aussi être intégrées au génome de la cellule (Gallais, 2013).
X. Références bibliographiques Gallais A (2013) De la domestication à la transgénèse-Évolution des outils pour l’amélioration des plantes, éditions Quae Hamad MIK, Daoud S, Petrova P, Rabaya O, Jbara A, Melliti N, Stichmann S, Reiss G, Herz J, Förster E (2020) Biolistic transfection and expression analysis of acute cortical slices. Journal of Neuroscience Methods 337: 108666 Sanford JC (1988) The biolistic process. Trends in Biotechnology 6: 299–302 Sobańska K, Cerazy-Waliszewska J, Kowalska M, Rakoczy M, Podkowiński J, Ślusarkiewicz-Jarzina A, Ponitka A, Jeżowski S, Pniewski T (2019) Optimised expression cassettes of hpt marker gene for biolistic transformation of Miscanthus sacchariflorus. Biomass and Bioenergy 127: 105255 Tagu D, Jaubert-Possamai S, Méreau A (2018) Principes des techniques de biologie moléculaire et génomique, éditions Quae Wellmann H, Kaltschmidt B, Kaltschmidt C (1999) Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun. Journal of Neuroscience Methods 92: 55–64 | ||
C |
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| MB | CANARY | |
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CANARY : Cellular Analysis and Notification of Antigen Risks and Yields I. Objectifs La technologie de biocapteur cellulaire CANARY (Cellular Analysis and Notification of Antigen Risks and Yields) permet d’identifier des pathogènes, protéines toxiques solubles ainsi que des séquences d’ARN/ADN dans des échantillons à la fois solides et liquides (nourriture, tissus végétaux et humains, échantillons médicamenteux, ...) (Rider et al., 2003 ; Tam et al., 2018). II. Principe Des lymphocytes B, un type de globules blancs, ont été génétiquement modifiés afin de se lier spécifiquement à des agents pathogènes cibles. Ces cellules expriment désormais : - Des anticorps liés à la membrane, spécifiques des antigènes d'intérêt. - L’aequorine cytosolique, une protéine bioluminescente. Lors de la formation du complexe anticorps/antigène, des modifications membranaires des lymphocytes B entraînent une augmentation de calcium intracellulaire. L’aequorine cytosolique, sensible au calcium, émet alors des photons (Figure 1) (Rider et al., 2003).
Figure 1 : Cascade d'induction créée par la liaison des lymphocytes B modifiées à l’antigène d'intérêt conduisant à l’émission de photons. Les applications des tests CANARY sont multiples : génotypage de pathogènes, tests de virulence, dépistages de résistance aux antibiotiques, détection d’agents pathogènes aux points d'entrée, contrôle des denrées périssables, … III. Mode opératoire Des cellules B spécifiques du pathogène à identifier sont préparées, puis ajoutées à l’échantillon d’intérêt dans un tube transparent. Grâce à une centrifugation rapide, les cellules sont culottées au fond du tube : cela permet qu’un grand nombre de lymphocytes B entre en contact physique avec l'antigène en peu de temps. Cela améliore considérablement la sensibilité et la vitesse de la manipulation. La luminescence du tube est mesurée grâce à un photodétecteur équipé d’un capteur de comptage de photons (Rider et al., 2003 ; Tam et al., 2018). IV. Intérêts et limites Cette méthode est hautement spécifique, à forte sensibilité, à prix abordable et surtout très rapide (les tests durent entre 1 et 5 min, Figure 2). La méthode CANARY concurrence donc la PCR qui dure 30 min et qui renvoie beaucoup de faux négatifs. Figure 2 : La réponse rapide de CANARY permet de couvrir de manière unique la zone de détection et de protection d'un rejet d'aérosol. En général, la limite de détection (LOD) de la méthode CANARY est de 10 à 10 000 unités formant colonie (ufc)/g ou mL (Tableau 1). Cependant, pour les agents pathogènes trop petits pour être rapidement sédimentés dans une microcentrifugeuse (virus entre autres), la LOD est de l'ordre de 50 000 unités formant plage (ufp) (Rider et al., 2003). Tableau 1 : limite de détection (LOD) du test CANARY pour des matrices complexes V. Présentation des résultats
Figure 3 : Courbe de dose-réponse obtenue via la méthode CANARY pour Yersinia pestis inactivé Figure 4 : Courbe de dose-réponse obtenue via la méthode CANARY pour l'Holotoxine BoNT/A. Le tableau adjacent montre la lecture générée à partir du test de biocapteur CANARY. Le résultat se présente sous la forme d’une courbe représentant la luminescence de l’échantillon (RLU : unité de lumière relative) au cours du temps lors de sa centrifugation (Rider et al., 2003 ; Tam et al., 2018). Les variations de luminescence sont générées par le fait qu’il y a un plus grand nombre de lymphocytes B qui entre en contact avec les agents pathogènes au début de la centrifugation qu’à la fin. VI. Interprétation des résultats Les résultats obtenus ci-dessus montrent que les cellules répondent très rapidement sur une large gamme dynamique de concentrations d'agents. Ainsi, plus il y a d’agents pathogènes présents dans l’échantillon, plus il y aura de lymphocytes modifiés qui se fixeront à eux, et donc plus la luminescence de l’échantillon sera élevée. En outre, la spécificité du système est démontrée par l'absence de réactivité croisée avec d'autres agents pathogènes. Ainsi, les courbes témoins associées aux différents agents pathogènes existants permettent à la fois de mesurer la quantité d’agents pathogènes présents dans l’échantillon, mais aussi d’attribuer un nom à l’agent analysé, grâce à la spécificité des lymphocytes B modifiés introduits dans l’échantillon. VII. Références bibliographiques Rider TH, Petrovick MS, Nargi FE, Harper JD, Schwoebel ED, Mathews RH, Blanchard DJ, Bortolin LT, Young AM, Chen J, et al (2003) A B Cell-Based Sensor for Rapid Identification of Pathogens. Science. 301: 213–215 Tam C, Flannery A, Cheng L (2018) A Rapid, Sensitive, and Portable Biosensor Assay for the Detection of Botulinum Neurotoxin Serotype A in Complex Food Matrices. Toxins. 10: 476 | ||
| LL | Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) | |
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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
1. Objectifs
L’immunoprécipitation de la chromatine est une méthode qui permet l’étude des protéines interagissant avec la molécule d’ADN. On obtient une représentation des interactions protéine–ADN qui ont lieu dans le noyau de la cellule vivante ou dans les tissus (in vivo). Elle est en général utilisée pour localiser des sites de fixation de facteurs de transcription, des sites associés avec des protéines de la chromatine, ou encore avec des histones possédant des modifications post-traductionnelles spécifiques.
2. Principe
Cette technologie se base d’abord sur la préparation de complexes protéine/ADN par action du formaldéhyde sur les cellules ou tissus puis sur l’immunoprécipitation de la chromatine en utilisant des anticorps spécifiques d’une protéine d’intérêt (présumée liée à l’ADN).
3. Mode opératoire
- La première étape est la formation de liaisons covalentes in vivo entre les protéines et l’ADN. En général, du formaldéhyde est ajouté sur des cellules, mais l’utilisation des UV ou de bleu de méthylène est aussi pratiquée. - Les cellules ainsi traitées sont ensuite lysées par sonification ou utilisation d’enzymes de restriction et des petits fragments d’ADN pontés (d’environ 200 à 500 paires de bases) sont obtenus. - On procède ensuite à l’immunoprécipitation de la chromatine pontée pour obtenir des complexes ADN/protéine purifiés grâce à un anticorps dirigé contre la protéine étudiée. Ceci permet de sélectionner les complexes du très grand nombre des autres fragments. Il est nécessaire d’avoir des anticorps d’une excellente qualité pour que la technique fonctionne correctement. - L’ADN précipité est ensuite purifié par chauffage pour annuler la réticulation par le formaldéhyde et l’ADN peut être séparé des protéines. Celles-ci sont digérées par la protéinase K. On obtient ainsi une collection de fragments d'ADN d'assez courte taille et dont on sait qu'ils interagissent avec une protéine d'intérêt (celle sélectionnée par l'anticorps).
Figure 1 : Mode opératoire de la méthode ChIP (Orlando, 1997) - On analyse ensuite l’ADN collecté grâce à une amplification par PCR et/ou à des puces à ADN en fonction de si la région du génome ciblé est connue.
4. Intérêts et limites
L’avantage majeur de la méthode ChIP est qu’elle s’effectue in vivo, c’est-à-dire que l’information tirée de cette expérience provient directement d’une analyse faite sur les cellules vivantes et l’immunoprécipitation permet de récupérer les protéines voulues ainsi que toutes les régions d’ADN auxquelles elles étaient liées lors du pontage initial au formaldéhyde. Cependant, malgré son succès la technique ChIP présente aussi des limites. Tout d’abord la résolution est limitée, on ne peut pas déduire la position précise du site de fixation de la protéine sur l’ADN, on identifie seulement une région de 200-300 pd dans laquelle se trouve le site de fixation ; on montre que la protéine se fixe en amont de tel gène mais sans que l’on sache où exactement. Une autre limite de la technique est que seules les protéines pour lesquelles on dispose d’anticorps peuvent être étudiées en ChIP. De plus les anticorps ont souvent le potentiel de réagir avec d'autres protéines nucléaires, malgré leur haute spécificité.
5. Présentation des résultats
L’étape clé de la technique de ChIP est la caractérisation de la région précise de l’ADN génomique qui fixe la protéine d’intérêt. On retrouve deux méthodes de caractérisation. La première est la technique par PCR en utilisant pour amorces des oligonucléotides correspondant aux gènes d’intérêt. Elle permet un enrichissement en séquences d’ADN reconnues par la protéine. Ainsi, la présence ou l’absence de séquence amplifiée révèle si oui ou non la protéine d’intérêt était liée à cette séquence d’ADN dans les cellules à partir desquelles la chromatine traitée au formaldéhyde a été isolée. Cependant, cette technique ne peut être utilisée que pour identifier des fragments connus et vérifier leur présence ou leur absence. On peut aussi caractériser les fragments par la technique Slot Blot.
Figure 2 : Présentation des résultats de la méthode ChIP (Kuo et Allis, 1999)
Quand on veut déterminer où la protéine est liée sur un génome à grande échelle, on peut utiliser une puce à ADN (Chip on chip). Dans cette approche, l’ADN total isolé de la cellule et l’ADN lié avec la protéine sont marqués chacun avec un fluorophore différent (dans la suite on parlera du fluorophore rouge pour l’ADN lié et du vert pour l’ADN total). Les deux ADN marqués sont mélangés et mis à hybrider sur la puce à ADN. C’est une approche très puissante puisqu’elle permet d’examiner simultanément tous les sites potentiels d’un génome entier sans qu’aucune connaissance préalable des sites potentiels ne soit nécessaire.
6. Interprétation des résultats
Dans le cas de l’analyse par PCR, si la protéine est fixée à la région de l’ADN attendue, alors l’ADN correspondant sera immunoprécipité lors de la ChIP et l’amplification sera possible. Deux contrôles importants sont nécessaires à ce stade. Le premier est d’inclure aussi deux amorces qui ciblent une autre région de l’ADN sur la laquelle la protéine étudiée est connue pour ne pas se fixer (aucune amplification ne devrait être observée ; c’est un contrôle négatif). D’autre part, on effectue une PCR sur un échantillon qui n'a pas subi une immunoprécipitation par des anticorps avec des amorces spécifiques et non spécifiques. Si les amorces PCR amplifient de la même façon leur cible, alors on devrait obtenir une amplification à peu près identique dans les deux cas. Ce contrôle permet de s’assurer que cette différence est significative d’une différence d’abondance des matrices et pas d’une différence d’efficacité entre les deux PCR. Après amplification, l’ADN est analysé par Slot Blot ou par Southern Blot. Dans le cas de l’analyse par puce à ADN, les zones de la puce à ADN qui ont un fort signal rouge sur vert correspondent aux séquences ayant fixé la protéine. Les zones de la puce à faible signal rouge sur vert sont les régions de l’ADN qui ne fixent pas la protéine étudiée.
7. Références bibliographiques
Carey, Michael F, Craig L Peterson, and Stephen T Smale. 2009. “Chromatin Immunoprecipitation (ChIP).” In Transcriptional Regulation in Eukaryotes: Concepts, Strategies, and Techniques, 2nd edition. Vol. 4. NY USA: CSHL Press. “Chip on Chip — Wikipédia.” 2015. July 3. http://fr.wikipedia.org/wiki/Chip_on_chip. Gilmour, David S, and John T Lis. 1985. “In Vivo Interactions of RNA Polymerase II with Genes of Drosophila Melanogaster,” Molecular and Cellular Biology, 5 (8): 2009–18. Gilmour, David S, and John T Lis. 1986. “RNA Polymerase II Interacts with the Promoter Region of the Noninduced hsp7O Gene in Drosophila Melanogaster Cells,” Molecular and Cellular Biology, 6 (11): 3984–89. “Immunoprécipitation — Wikipédia.” 2014. October 12. http://fr.wikipedia.org/wiki/Immunopr%C3%A9cipitation. Kuo, Min-Hao, and C. David Allis. 1999. “In Vivo Cross-Linking and Immunoprecipitation for Studying Dynamic Protein:DNA Associations in a Chromatin Environment,” November, Methods 19 edition, sec. 425-433. Locker, D. 2015. “‘ChIP on Chip’ Ou Comment Suivre La Technologie Des Gènes.” Accessed March 20. http://daniel.locker.perso.sfr.fr/article%20vulgarisation/CHIPonCHIP4.pdf Orlando, Valerio, Helen Strutt, and Renato Paro. 1997. “Analysis of Chromatin Structure by in Vivo Formaldehyde Cross-Linking,” METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 11 edition. Watson, James, Tania Baker, Stephen Bell, Alexander Gann, Michael Levine, and Richard Losick. 2009a. “L’approche ChIP-Chip: La Meilleure Pour Identifier Des Enhancers.” In Biologie Moléculaire Du Gène, 6e edition. Pearson Education France. Watson, James, Tania Baker, Stephen Bell, Alexander Gann, Michael Levine, and Richard Losick. 2009b. “L’immuno-Précipitation E La Chromatine Permet de Détecter L’association Des Protéines Avec l’ADN Dans La Cellule.” In Biologie Moléculaire Du Gène, 6e edition. Pearson Education France.
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| AG | CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE ET SPECTROMETRIE DE MASSE (LC-MS) | ||
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I) Objectifs LC-MS, tirée de l’anglais Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, est une technique de laboratoire de chimie analytique pour l'identification, la quantification et l'analyse de masse de nombreuses substances. Comme son nom l’indique, elle combine les performances de la chromatographie en phase liquide et de la spectrométrie de masse. Ce couplage est aujourd’hui un des plus puissants utilisés par les chimistes et biochimistes en matière d’analyse qualitative (Arpino, 2009). La technique LC/MS peut être utilisée dans l'industrie pour détecter les contaminants à l'état de traces, mais aussi en industrie cosmétique et pharmaceutique, pour détecter des impuretés. Sur le plan environnemental, la LC-MS est utilisée pour l'analyse de divers échantillons tels que le sol, l'eau potable ou les eaux usées, l'air et les boues (détection de pesticides, d’herbicides). L’utilisation se fait aussi dans le domaine biomédical pour identifier des protéines, des lipides…. II) Principe Cette technique consiste en la succession de deux étapes :
III) Mode opératoire La LC-MS repose principalement sur l’utilisation d’un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et d’un système de spectrométrie de masse (MS). Le système HPLC permet la séparation des différents composants d’un échantillon liquide. En utilisant une phase stationnaire hydrophobe et une phase mobile polaire, il y a migration différentielle dans la colonne de chromatographie. Les molécules arrivent tour à tour à travers un PDA (photodiode array = réseau de photo diode) où le temps de rétention du composé dans la colonne ainsi que son absorbance vont pouvoir être mesurés (obtention d’un Dt, lmax). Les molécules migrent ensuite vers le système MS. Le système MS permet l’ionisation des molécules, par électrospray (ESI), ou par ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI). Une fois rentrées dans le spectromètre de masse, les molécules chargées se dirigent ensuite dans un quadrupôle constitué de quatre tiges de charges, alternant rapidement entre charges positives et négatives. Cela induit des oscillations des ions. Seuls les ions qui n’heurtent pas les tiges de charges traversent le système et frappent le détecteur à l’extrémité du système. En fonction de la charge enregistrée par le quadrupôle à l’instant t de l’impact de la particule ionisée et des équations de mouvements, l’analyseur détermine le poids moléculaire (massenombre de charge=mz) du composé (Ying, 2022).
Figure 1 : Schéma du fonctionnement d’une LC-MS (Kailasam, 2022 d’après Cwszot, Dagui1929, Yassine Mrabet and Cas Ju reproduced under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication license.)
Figure 2: Schéma d’un quadrupôle (Paul J. Gates, 2014, University of Bristol) IV) Présentation des résultats Une analyse LC-MS contient des informations sur le temps de rétention (RT) distinct pour chaque molécule, dans le chromatogramme, le rapport masse sur charge (m/z) dans le MS et l'abondance relative des ions pour chaque ion particulier. Les signaux MS détectés dans toute la gamme de séparation chromatographique sont formatés dans une carte tridimensionnelle, qui définit les données d'un seul passage LC-MS, comme le montre la Figure 3.
A. Figure 3 : Analyse LC-MS à la sortie du MS. Fig3.A (Tsai et al, 2016), Fig 3.B (Zhou et al, 2012) V) Interprétation des résultats L’aire sous le pic du spectre de rétention, permet de déterminer la concentration en analyte, par utilisation d’un pic de référence de l’isotope correspondant de concentration connue. A partir de la position du pic issu du spectre de masse, la masse de l’ion moléculaire est déterminée par comparaison aux tables. Lorsqu’un groupe de pics est observé sur le spectre de masse (m/z), cela correspond à un ensemble d’isotopes. VI) Intérêts et limites Avantages : LC-MS est une technique de haute sensibilité qui permet l’analyse de composés polaires, apolaires, d’ions et de molécules thermolabiles. Cette analyse simultanée induit ainsi une réduction du temps et du coût de la réalisation. De plus, selon ce que les chercheurs souhaitent montrer, par la diversité des colonnes à chromatographie, il est possible d’obtenir une séparation plus ou moins importantes des composés entre eux. Elle permet également de déterminer la masse moléculaire d’analytes de taille inférieure à 1 000 Da à des analytes de taille supérieure à 100 000 Da. Pour finir, en couplant les deux informations obtenues par la LC-MS (masse moléculaire et lmax), les chances d'identifier des mélanges complexes ainsi que des composés inconnus sont augmentées. Limites : L’appareillage de la LC-MS et l’analyse ultérieure des résultats peut être onéreux selon les revenus des laboratoires l’utilisant. Il y a une variabilité importante des spectres obtenus en sortie de LC, ce qui pourrait gêner l’identification. Les isomères ne peuvent pas être distingués. Leur masse est la même, mais pas leur structure. Le spectromètre de masse est un détecteur destructif, il faut donc faire attention lors de la manipulation d'échantillons qui peuvent ne pas être facilement disponibles. Enfin, l'analyse d'échantillons instables par LC-MS peut s'avérer difficile (Kailasam, 2022). VII) Références bibliographiques Arpino P (2009) Couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse. Techniques d’analyse. III (P1492). 1-24. doi: 10.51257/a-v1-p1492 Gates P (2014) Quadrupole Mass Analysis. UNIVERSITY OF BRISTOL. Consulté le 20 février 2023. http://www.chm.bris.ac.uk/ms/quadrupole.xhtml Kailasam S (2022) LC-MS – What Is LC-MS, LC-MS Analysis and LC-MS/MS. Technology Networks. Analysis & Separations. Consulté le 28 février 2023. https://www.technologynetworks.com/analysis/articles/lc-ms-what-is-lc-ms-lc-ms-analysis-and-lc-msms-348238#D2 Tsai T-H, Wang M, Ressom HW (2016) Preprocessing and Analysis of LC-MS-Based Proteomic Data. In K Jung, ed, Statistical Analysis in Proteomics. Springer New York, New York, NY, pp 63–76 Ying Z (2022) Qu’est-ce que la LC-MS. ANTITECK. Consulté le 20 février 2023. https://antiteck.com/fr/qu%27est-ce-que-lc-ms/ Zhou B, Xiao JF, Tuli L, Ressom HW (2012) LC-MS-based metabolomics. Mol BioSyst 8: 470–481 Réalisé par : DUFRENE Marjorie, GONAND Alix, POIRIER-COUTANSAIS Auriane, 2023
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B.
| LM | Chromosome Conformation Capture | |
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Chromosome conformation capture (3C)
I) Objectifs La Capture de Conformation Chromosomique (3C) est une technique décrite pour la première fois par Job Dekker et ses collègues en 2002, qui permet l’étude de la structure 3D de la chromatine. Elle fournit des informations sur la structure 3D et les interactions des chromosomes in vivo à une échelle de quelques dizaines à quelques centaines de paires de kilobases (Vernet, 2013). Elle a pour but d’étudier l’organisation spatiale du génome, paramètre de contrôle de l’expression des gènes ainsi que sa dynamique au cours de différents processus biologiques tels que le cycle cellulaire, la mitose, la méiose…
II) Principe Cette méthode permet la détection des interactions chromosomiques, c’est-à-dire des contacts physiques directs ou indirects (médiés par des complexes ribonucléoprotéiques) entre une séquence cible et un ensemble de séquences prédites ou connues pour interagir avec la cible. Elle est applicable sur des populations cellulaires de nombreux organismes, allant des bactéries à l’Homme. III) Mode opératoire La méthode 3C nécessite deux étapes principales: la génération de produits de ligation et leur détection (Fig.1). Dans la première étape, les cellules sont fixées au formaldéhyde, les noyaux sont isolés, et les segments de chromatine spatialement proches sont réticulés de manière covalente au niveau d’un cross-link. Il peut s’agir de liaisons intra-chromosomiques ou inter-chromosomiques (Umlauf, 2015). Les fragments de chromatine à analyser sont ensuite coupés par des enzymes de restriction spécifiques, et subissent une ligation de manière à rabouter ensemble les portions de chromatine reliées par le cross-link. Puis, les produits de ligation sont purifiés. La deuxième étape consiste en une PCR (Hagège et al, 2007). Pour la méthode 3C, une vérification des interactions entre une séquence cible précise et des séquences prédites ou connues est réalisée. Grâce à cela, une PCR est conçue en choisissant les amorces spécifiques correspondantes (Gerosa, 2012). Deux types de PCR sont utilisés : la PCR semi-quantitative qui se base sur une électrophorèse sur gel, ou la PCR quantitative en ayant recours à des amorces fluorescentes.
Figure 1: Étapes de la méthode Capture de Conformation Chromosomique (Moindrot, 2012). IV) Présentation des résultats L’analyse de la PCR repose sur l’étude de l’intensité des bandes des amplicons qui reflète directement l’abondance du produit de ligation, et donc la proximité des deux segments de chromatine dans le noyau ou le cytoplasme.
Figure 2 : Révélation de la PCR (Dekker et al,
2002). Pour s’assurer de la pertinence des résultats, un contrôle est réalisé dans lequel est construit un chromosome bactérien contenant les séquences d’ADN des produits de ligation supposés (Fig.2). L’amplification par PCR permet d’analyser les cross-links (Hagège et al, 2007). Cela permet de s’assurer que les signaux obtenus ne sont pas dus à des problèmes liés à la technique : non amplification d’un fragment lors de la PCR dû à un mauvais choix d’amorce, par exemple, ou à une trop faible quantité d’ADN introduite. Sur ces graphiques, les interactions du fragment 6 (fragment cible) avec les fragments 5 et 13 sont étudiées. Seul le produit de ligation associant les fragments 5 et 6 est amplifié, alors que ce fragment est amplifié dans le contrôle. Même si le traitement statistique n’est ici pas présent, il semblerait que ces fragments de chromatine 5 et 6 interagissent au sein du noyau contrairement à 6 et 13.
V) Interprétation des résultats Les premiers résultats de l’utilisation de la méthode obtenus par l’équipe de Dekker sont présentés ci dessous :
Figure 3, 4 : Tableau des interactions de la chromatine (Dekker et al, 2002), Représentation 3D du chromosome III de S.cerevisiae (Dekker et al, 2002). Le tableau (Fig.3) présente les distances, en nm, entre les différents segments de chromatine. La proximité des segments est illustrée par des cases de couleurs. L’intensité est d’autant plus élevée que les segments sont proches. La diagonale descendante (de gauche à droite) montre que la distance des fragments successifs est faible : elle illustre le fait que plus deux segments sont proches en nombre de paires de bases sur le chromosome, plus elles sont proches spatialement. La diagonale ascendante révèle la proximité de fragments non successifs, mais qui sont proches spatialement : cela est interprété par la formation de boucles et repliements de la chromatine. La représentation 3D de la chromatine (Fig.4) permet une visualisation claire de la conformation de la chromatine. Il s’agit ici du chromosome III de la levure du boulanger Saccharomyces cerevisiae, obtenu en moyennant les conformations recueillies sur une population de levures.
VI) Intérêts et limites L’avantage majeur de la méthode 3C est qu’elle récupère l’information de conformation de la chromatine in vivo, c’est-à-dire que les produits d’analyses obtenus proviennent directement des cellules vivantes. De plus, elle assure l’obtention de cartes d’organisation spatiale de la chromatine. Elle renseigne ainsi sur les éventuels réarrangements du génome, sans avoir besoin de réaliser un fractionnement cellulaire ou de chromatine. La préparation de l’expérience requiert néanmoins un travail laborieux et chronophage. Il s’agit de la partie critique de la procédure, puisque la résolution et la sensibilité de la technique dépendent en grande partie de sa conception expérimentale. De nouvelles techniques basées sur la 3C ont émergé, chacune ayant des particularités et des applications différentes : La Capture de Conformation Chromosomique Circulaire (4C) est la suite de la méthode 3C. Elle permet de déterminer la nature des séquences en interaction avec une région chromosomique précise, sans présumer de leur identité alors que la méthode 3C consistait à vérifier des interactions prédites ou connues. Enfin, la Capture de la Conformation Chromosomique en Copie de Carbone (5C), permet quant à elle, d’étudier le génome entier (Umlauf, 2015). Par ailleurs, il existe des variantes de la méthode 3C qui sont les méthodes 3C Hi-C et 3C ChiA-PET.
VII) Références bibliographiques
Job Dekker, Karsten Rippe, Martijn Dekker, Nancy Kleckner. (2002). Capturing chromosome conformation. Science. 295, 1306-11. Rahel Gerosa. (2012). Chromosome Conformation Capture. http://www.rna..uzh.ch/dam/jcr:ffffffff-b34e-2810-0000-0000308a3cc2/JC20121106.pdf
Hélène Hagège, Petra Klous, Caroline Braem, Erik Splinter, Job Dekker, Guy Cathala, Wouter de Laat & Thierry Forné. (2007). Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature protocols. 2,1722 – 1733.
Benoît Moindrot. (2012). Organisation de la chromatine et son lien avec la réplication de l’ADN. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00733254/document.
David Umlauf. (2015). Le génome intime…et en trois dimensions. Medecine Sciences. 31, 304-311.
Agnès Vernet. (2013). Dans l’intimité chromosomique d’une cellule. Biofutur. http://www.biofutur.com/Dans-l-intimite-chromosomique-d-une-cellule.
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| VR | COLORATION DE L’HEMOGLOBINE : LA O-DIANISIDINE | ||
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Coloration de l’hémoglobine : la o-Dianisidine.
I) Objectifs La coloration de l’hémoglobine à la o-Dianisidine est une méthode permettant la visualisation directe des érythrocytes. Elle peut notamment être utilisée pour détecter de potentiels défauts dans l'hématopoïèse de certains animaux modèles, tels que le poisson-zèbre (Paffett-Lugassy et al., 2004) ou le xénope (Huber et al., 1998). Cela permet notamment d’étudier l’impact d’une mutation génétique sur le taux d’hémoglobine, et de mettre en évidence un défaut d'érythropoïèse aux stades embryonnaire ou larvaire le plus souvent. Après coloration à la o-Dianisidine, une couleur rouge-marron est observée révélant les érythrocytes. Il est alors possible de quantifier cette coloration, en mesurant son intensité par exemple. Cette technique est surtout utilisée en recherche. II) Principe La o-Dianisidine est un substrat de la peroxydase (Merck, 2010). Or, l’hémoglobine peut, en présence de H2O2, avoir une activité péroxydase (Kapralov et al., 2009), jouant alors le rôle d’une enzyme de type oxydase. L’hémoglobine catalyse alors la réaction d’oxydation de la o-Dianisidine par l’eau oxygénée (Sun et al., 2005). Cela a pour effet la formation d’un précipité de couleur rouge-marron, révélant alors les érythrocytes. Cette méthode est notamment utilisée pour révéler une érythropoïèse imparfaite, notamment dans le cas de maladies rares telles que l’anémie de Diamond-Blackfan, ou encore pour étudier l'hématopoïèse au cours du développement embryonnaire. La o-Dianisidine est capable de détecter de très faibles taux d’hémoglobine, qui ne seraient pas observables par Western blot notamment (Hubert et al., 1998). III) Mode opératoire L’opération de coloration peut se dérouler sur des embryons préalablement déchorionés ou des cellules sanguines. Cette technique nécessite d’immerger ces derniers dans un mélange de 2 mL de ddH2O, 500 µL de NaOAc qui sert de tampon, 100 µL d’H2O2, réactif qui réagit avec les 2 mL de colorant o-Dianisidine en oxydant celle-ci. Ce travail se fait sous hotte car la o-Dianisidine est hautement toxique. Après immersion, les cellules ou embryons sont incubés entre 15 et 45 minutes dans le noir à température ambiante. Cette durée dépend principalement du taux d’hémoglobine. Après incubation, les échantillons présentent une couleur rouge-marron. Ceux-ci subissent ensuite trois lavages à l’eau bidistillée pour enlever le surplus de colorant. La coloration est fixée avec du paraformaldéhyde. Pour finir, une deuxième série de lavages est effectuée avec du PBST (Phosphate Buffer Saline Tween), une solution saline à laquelle est ajouté un détergent (appelé Tween). Cette étape sert à enlever les résidus de paraformaldéhyde. Les échantillons ainsi colorés peuvent être conservés à 4 °C. IV) Présentation des résultats Une fois la coloration effectuée, les échantillons peuvent être visualisés et photographiés au microscope. Une première étude qualitative permet de visualiser la présence ou non d’érythrocytes (Figure 1) ou bien de voir un déficit en hémoglobine (Figure 2 (a)).
Figure 1 : Les cellules érythroïdes sont détectées dans la calotte animale d’embryons de xénope et traitées avec BMP-4 et des inducteurs du mésoderme. (A) Pour les expériences utilisant le plasmide BMP-4, les embryons sont injectés avec le vecteur de contrôle ou pcDNA3-BMP-4 (200 pg) et traités avec de l'activine (12 ng/mL) ou du FGF (200 ng/mL). (B) Pour les expériences utilisant la protéine BMP-4, les calottes animales sont excisées au stade 8 et dispersées dans la CMFM. La dispersion cellulaire est traitée avec BMP-4 (1 μg/mL) avec et sans activine (12 ng/mL) dans CMFM pendant 2 heures avant que les cellules ne soient lavées et autorisées à se regrouper à nouveau dans la solution de culture de coiffe contenant du calcium et du magnésium. Dans les deux expériences, les cellules de la coiffe sont cultivées jusqu'au stade de contrôle 35 et les cellules positives à la o-dianisidine sont analysées. La pointe de flèche indique une cellule érythroïde. La flèche noire indique une cellule pigmentée non érythroïde. Les panneaux de (A) ont été photographiés à un grossissement original de 20× et les panneaux de (B) ont été photographiés à un grossissement original de 10×. (Huber et al., 1998).
En plus d’une observation qualitative, il est possible de quantifier comparativement à un témoin les résultats obtenus, notamment à l’aide de logiciels tels que Fiji ImageJ. En délimitant un ROI, ou Region Of Interest, il est ainsi possible d’obtenir un ensemble de mesures d’intensité de coloration, ou encore de surface relative de coloration (Figure 2 (b) et (c)).
Figure 2 : (a) Images de larves colorées à la o-Dianisidine. (b) Mesure de l'intensité de la coloration en fonction des traitements administrés. (c) Proportion d’aire colorée. ** indique une p-value<0.01 et **** indique une p-value < 0.0001. n indique le nombre de larves. Source : rapport de stage mission.
V) Interprétation des résultats L’étude ayant mené à la Figure 1 porte sur les effets coopératifs des facteurs de croissance impliqués dans l'induction du mésoderme hématopoïétique. La coloration à la o-Dianisidine a permis de visualiser les érythrocytes et ainsi de visualiser l'hématopoïèse en fonction de diverses conditions. La Figure 2 présente l’effet de divers traitements sur des larves de poissons-zèbres porteurs d’une mutation sur un gène ribosomique et potentiellement atteintes de l’anémie de Diamond-Blackfan. Il est visible en (a) que les larves ont une forte concentration d’hémoglobine dans la région du cœur. Il y a bien une diminution visuelle entre le contrôle (STD sgRNA) et les larves porteuses d’une mutation avec et sans traitement. Ces résultats se confirment en observant l’intensité (b) et la surface de la coloration (c). VI) Intérêts et limites Le principal avantage de cette technique est la facilité avec laquelle l’hémoglobine fonctionnelle est visible. Cela représente un intérêt par rapport aux lignées transgéniques permettant de visualiser l’expression de certains gènes, mais qui ne permettent pas de s’assurer que la protéine, ici l’hémoglobine, est fonctionnelle. Il y a cependant deux inconvénients majeurs à cette méthode. En effet, c’est un processus toxique, donc les larves ou cellules ne survivent pas à la coloration. Cela rend impossible un suivi dans le temps, notamment lorsque l’expérimentateur souhaite étudier l’effet d’une maladie, puis d’un traitement médicamenteux sur une même larve. Par ailleurs, cette technique d’étude utilise des réactifs fortement toxiques, nécessitant de grandes précautions de son expérimentateur.
VII) Références bibliographiques Huber TL, Zhou Y, Mead PE, Zon LI. (1998). Cooperative Effects of Growth Factors Involved in the Induction of Hematopoietic Mesoderm. Blood. 92, 4128–4137 Kapralov A, Vlasova II, Feng W, Maeda A, Walson K, Tyurin VA, Huang Z, Aneja RK, Carcillo J, Bayır H, et al. (2009). Peroxidase Activity of Hemoglobin·Haptoglobin Complexes. J Biol Chem. 284, 30395–30407. Merck. (2010). o-Dianisidine peroxidase substrate. 119-90-4. https://www.sigmaaldrich.com/FR/fr/product/sigma/d9143?utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_id=20847909024&utm_campaign=%7Bcampaignname%7D&utm_content=156685797076&utm_term=o-+dianisidine&gad_source=1&gclid=CjwKCAiA5eC9BhAuEiwA3CKwQpse-CYp4TzIyP40ob182SQ4JU_bB3i_QD40113vK1u3ynTU0KUGaBoCN1gQAvD_BwE. Paffett-Lugassy NN, Zon LI. (2004). Analysis of Hematopoietic Development in the Zebrafish. Developmental Hematopoiesis. Humana Press, New Jersey. pp 171–198. Sun W, Jiang H, Jiao K. (2005). Electrochemical determination of hydrogen peroxide usingo-dianisidine as substrate and hemoglobin as catalyst. J Chem Sci. 117, 317–322. | |||
