LC-MS, tirée de l’anglais Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, est une technique de laboratoire de chimie analytique pour l'identification, la quantification et l'analyse de masse de nombreuses substances. Comme son nom l’indique, elle combine les performances de la chromatographie en phase liquide et de la spectrométrie de masse.
Ce couplage est aujourd’hui un des plus puissants utilisés par les chimistes et biochimistes en matière d’analyse qualitative (Arpino, 2009).
La technique LC/MS peut être utilisée dans l'industrie pour détecter les contaminants à l'état de traces, mais aussi en industrie cosmétique et pharmaceutique, pour détecter des impuretés. Sur le plan environnemental, la LC-MS est utilisée pour l'analyse de divers échantillons tels que le sol, l'eau potable ou les eaux usées, l'air et les boues (détection de pesticides, d’herbicides). L’utilisation se fait aussi dans le domaine biomédical pour identifier des protéines, des lipides….
II) Principe
Cette technique consiste en la succession de deux étapes :
Une chromatographie en phase liquide qui permet la séparation des différentes molécules d’un mélange.
Dans le spectromètre de masse, il y a formation d’ions, sans décomposition ni fragmentation des molécules, puis séparation des ions basé sur leur ratio masse/charge.
III) Mode opératoire
La LC-MS repose principalement sur l’utilisation d’un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et d’un système de spectrométrie de masse (MS).
Le système HPLC permet la séparation des différents composants d’un échantillon liquide. En utilisant une phase stationnaire hydrophobe et une phase mobile polaire, il y a migration différentielle dans la colonne de chromatographie. Les molécules arrivent tour à tour à travers un PDA (photodiode array = réseau de photo diode) où le temps de rétention du composé dans la colonne ainsi que son absorbance vont pouvoir être mesurés (obtention d’unDt, lmax). Les molécules migrent ensuite vers le système MS.
Le système MS permet l’ionisation des molécules, par électrospray (ESI), ou par ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI). Une fois rentrées dans le spectromètre de masse, les molécules chargées se dirigent ensuite dans un quadrupôle constitué de quatre tiges de charges, alternant rapidement entre charges positives et négatives. Cela induit des oscillations des ions. Seuls les ions qui n’heurtent pas les tiges de charges traversent le système et frappent le détecteur à l’extrémité du système. En fonction de la charge enregistrée par le quadrupôle à l’instant t de l’impact de la particule ionisée et des équations de mouvements, l’analyseur détermine le poids moléculaire (massenombre de charge=mz) du composé (Ying, 2022).
Figure 1: Schéma du fonctionnement d’une LC-MS (Kailasam, 2022 d’aprèsCwszot, Dagui1929, Yassine Mrabet and Cas Ju reproducedunder the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedicationlicense.)
Figure 2: Schéma d’un quadrupôle (Paul J. Gates, 2014, University of Bristol)
IV) Présentation des résultats
Une analyse LC-MS contient des informations sur le temps de rétention (RT) distinct pour chaque molécule, dans le chromatogramme, le rapport masse sur charge (m/z) dans le MS et l'abondance relative des ions pour chaque ion particulier. Les signaux MS détectés dans toute la gamme de séparation chromatographique sont formatés dans une carte tridimensionnelle, qui définit les données d'un seul passage LC-MS, comme le montre la Figure 3.
A.B.
Figure 3 : Analyse LC-MS à la sortie du MS. Fig3.A (Tsai et al, 2016), Fig 3.B (Zhou et al, 2012)
V) Interprétation des résultats
L’aire sous le pic du spectre de rétention, permet de déterminer la concentration en analyte, par utilisation d’un pic de référence de l’isotope correspondant de concentration connue.
A partir de la position du pic issu du spectre de masse, la masse de l’ion moléculaire est déterminée par comparaison aux tables.
Lorsqu’un groupe de pics est observé sur le spectre de masse (m/z), cela correspond à un ensemble d’isotopes.
VI) Intérêts et limites
Avantages :
LC-MS est une technique de haute sensibilité qui permet l’analyse de composés polaires, apolaires, d’ions et de molécules thermolabiles. Cette analyse simultanée induit ainsi une réduction du temps et du coût de la réalisation.
De plus, selon ce que les chercheurs souhaitent montrer, par la diversité des colonnes à chromatographie, il est possible d’obtenir une séparation plus ou moins importantes des composés entre eux.
Elle permet également de déterminer la masse moléculaire d’analytes de taille inférieure à 1 000 Da à des analytes de taille supérieure à 100 000 Da.
Pour finir, en couplant les deux informations obtenues par la LC-MS (masse moléculaire et lmax), les chances d'identifier des mélanges complexes ainsi que des composés inconnus sont augmentées.
Limites :
L’appareillage de la LC-MS et l’analyse ultérieure des résultats peut être onéreux selon les revenus des laboratoires l’utilisant.
Il y a une variabilité importante des spectres obtenus en sortie de LC, ce qui pourrait gêner l’identification.
Les isomères ne peuvent pas être distingués. Leur masse est la même, mais pas leur structure.
Le spectromètre de masse est un détecteur destructif, il faut donc faire attention lors de la manipulation d'échantillons qui peuvent ne pas être facilement disponibles. Enfin, l'analyse d'échantillons instables par LC-MS peut s'avérer difficile (Kailasam, 2022).
VII) Références bibliographiques
Arpino P (2009) Couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse. Techniques d’analyse. III (P1492). 1-24. doi: 10.51257/a-v1-p1492
Tsai T-H, Wang M, Ressom HW (2016) Preprocessing and Analysis of LC-MS-Based Proteomic Data. In K Jung, ed, Statistical Analysis in Proteomics. Springer New York, New York, NY, pp 63–76
B.