CANARY : Cellular Analysis and Notification of Antigen Risks and Yields
I. Objectifs
La technologie de biocapteur cellulaire CANARY (Cellular Analysis and Notification of Antigen Risks and Yields) permet d’identifier des pathogènes, protéines toxiques solubles ainsi que des séquences d’ARN/ADN dans des échantillons à la fois solides et liquides (nourriture, tissus végétaux et humains, échantillons médicamenteux, ...) (Rider et al., 2003 ; Tam et al., 2018).
II. Principe
Des lymphocytes B, un type de globules blancs, ont été génétiquement modifiés afin de se lier spécifiquement à des agents pathogènes cibles. Ces cellules expriment désormais :
- Des anticorps liés à la membrane, spécifiques des antigènes d'intérêt.
- L’aequorine cytosolique, une protéine bioluminescente. Lors de la formation du complexe anticorps/antigène, des modifications membranaires des lymphocytes B entraînent une augmentation de calcium intracellulaire. L’aequorine cytosolique,sensible au calcium, émet alors des photons (Figure 1) (Rider et al., 2003).
Figure 1 : Cascade d'induction créée par la liaison des lymphocytes B modifiées à l’antigène d'intérêt conduisant à l’émission de photons.
Les applications des tests CANARY sont multiples : génotypage de pathogènes, tests de virulence, dépistages de résistance aux antibiotiques, détection d’agents pathogènes aux points d'entrée, contrôle des denrées périssables, …
III. Mode opératoire
Des cellules B spécifiques du pathogène à identifier sont préparées, puis ajoutées à l’échantillon d’intérêt dans un tube transparent. Grâce à une centrifugation rapide, les cellules sont culottées au fond du tube : cela permet qu’un grand nombre de lymphocytes B entre en contact physique avec l'antigène en peu de temps. Cela améliore considérablement la sensibilité et la vitesse de la manipulation. La luminescence du tube est mesurée grâce à un photodétecteur équipé d’un capteur de comptage de photons (Rider et al., 2003 ; Tam et al., 2018).
IV. Intérêts et limites
Cette méthode est hautement spécifique, à forte sensibilité, à prix abordable et surtout très rapide (les tests durent entre 1 et 5 min, Figure 2). La méthode CANARY concurrence donc la PCR qui dure 30 min et qui renvoie beaucoup de faux négatifs.
Figure 2 : La réponse rapide de CANARY permet de couvrir de manière unique la zone de détection et de protection d'un rejet d'aérosol.
En général, la limite de détection (LOD) de la méthode CANARY est de 10 à 10 000 unités formant colonie (ufc)/g ou mL (Tableau 1). Cependant, pour les agents pathogènes trop petits pour être rapidement sédimentés dans une microcentrifugeuse (virus entre autres), la LOD est de l'ordre de 50 000 unités formant plage (ufp) (Rider et al., 2003).
Tableau 1 : limite de détection (LOD) du test CANARY pour des matrices complexes
V. Présentation des résultats
Figure 3 : Courbe de dose-réponse obtenue via la méthode CANARY pour Yersinia pestis inactivé
Figure 4 : Courbe de dose-réponse obtenue via la méthode CANARY pour l'Holotoxine BoNT/A. Le tableau adjacent montre la lecture générée à partir du test de biocapteur CANARY.
Le résultat se présente sous la forme d’une courbe représentant la luminescence de l’échantillon (RLU : unité de lumière relative) au cours du temps lors de sa centrifugation (Rider et al., 2003 ; Tam et al., 2018). Les variations de luminescence sont générées par le fait qu’il y a un plus grand nombre de lymphocytes B qui entre en contact avec les agents pathogènes au début de la centrifugation qu’à la fin.
VI. Interprétation des résultats
Les résultats obtenus ci-dessus montrent que les cellules répondent très rapidement sur une large gamme dynamique de concentrations d'agents. Ainsi, plus il y a d’agents pathogènes présents dans l’échantillon, plus il y aura de lymphocytes modifiés qui se fixeront à eux, et donc plus la luminescence de l’échantillon sera élevée.
En outre, la spécificité du système est démontrée par l'absence de réactivité croisée avec d'autres agents pathogènes.
Ainsi, les courbes témoins associées aux différents agents pathogènes existants permettent à la fois de mesurer la quantité d’agents pathogènes présents dans l’échantillon, mais aussi d’attribuer un nom à l’agent analysé, grâce à la spécificité des lymphocytes B modifiés introduits dans l’échantillon.
VII. Références bibliographiques
Rider TH, Petrovick MS, Nargi FE, Harper JD, Schwoebel ED, Mathews RH, Blanchard DJ, Bortolin LT, Young AM, Chen J, et al (2003) A B Cell-Based Sensor for Rapid Identification of Pathogens. Science. 301: 213–215
Tam C, Flannery A, Cheng L (2018) A Rapid, Sensitive, and Portable Biosensor Assay for the Detection of Botulinum Neurotoxin Serotype A in Complex Food Matrices. Toxins. 10: 476
