La méthode Adipo-Clear permet d’obtenir une visualisation 3D d’un dépôt adipeux entier en éliminant son contenu lipidique grâce à un processus d’éclaircissement. L’imagerie tridimensionnelle du tissu adipeux est en effet très complexe, en raison des effets d’obstruction de la lumière causés par les interactions entre les lipides et l’eau. Adipo-Clear constitue une adaptation de la méthode iDISCO/iDISCO+, spécifiquement conçue pour améliorer l’imagerie 3D des tissus adipeux. Grâce à cette approche, il devient possible d’analyser les interactions entre les projections nerveuses, le système vasculaire, les cellules immunitaires et les adipocytes au sein du dépôt adipeux (Chi et al., 2018b), d’étudier le développement du tissu adipeux (Chi et al., 2018b), ou de visualiser l’expression protéique au sein du tissu (Henriques et al., 2020).
II) Principe
La méthode Adipo-Clear repose sur la délipidation du tissu adipeux à l’aide de méthanol et de dichlorométhane pour atteindre une transparence du tissu adaptée à la microscopie de fluorescence à feuille de lumière (Chi et al., 2018a).
III) Mode opératoire
La méthode Adipo-Clear comprend plusieurs étapes, du prélèvement du tissu disséqué à la visualisation 3D du tissu :
1)Préparation du tissu :
➢Prélèvement du tissu par dissection,
➢ Fixation du tissu dans une solution de formaldéhyde à 4%,
➢Lavage du tissu trois fois avec du PBS (Phosphate-Buffered Saline),
2)Perméabilisation et délipidation :
➢Déshydratation progressive par un gradient croissant de méthanol,
➢Délipidation au dichlorométhane (DCM),
➢Blocage par un gradient décroissant de méthanol,
3)Immunomarquage :
➢Incubation avec les anticorps primaires,
➢Incubation avec les anticorps secondaires,
➢Lavage avec le tampon Whole mount blocking buffer,
➢Enrobage du tissu dans de l’agarose,
4)Nettoyage et éclaircissement du tissu :
➢Lavage par un gradient croissant de méthanol,
➢Incubation avec du dichlorométhane, puis avec de l’éthyl cinnamate (ECI).
5)Microscopie à feuille de lumière
IV) Présentation des résultats
Les dépôts adipeux entiers préparés avec Adipo-Clear peuvent être visualisés en 3D pour étudier les interactions entre les cellules immunitaires et les adipocytes (figure 1).
Figure 1 : Imagerie 3D des « structures en forme de couronne » dans un dépôt de tissu adipeux blanc épididymaire préparé avec Adipo-Clear, isolé d'une souris mâle nourrie avec un régime riche en graisses pendant 16 semaines. L'échantillon a été immunomarqué pour les cellules endothéliales (rouge) et pour les macrophages (bleu).
V) Interprétation des résultats
Dans un état d'obésité, le tissu adipeux devient inflammé, ce qui s'accompagne de l'infiltration de macrophages pro-inflammatoires formant des structures en « couronne » autour des adipocytes morts. Les dépôts adipeux des animaux obèses sont particulièrement difficiles à éclaircir en raison de leur grande taille et de leur teneur élevée en lipides. Cependant, la méthode Adipo-Clear permet un éclaircissement homogène de l’ensemble du tissu chargé en lipides.
VI) Intérêts et limites
L'étape de délipidation élimine entièrement les lipides du tissu adipeux, facilitant ainsi le marquage immunologique sur l'ensemble du tissu et limitant la diffusion de la lumière. Cela permet une imagerie homogène, sans perte de résolution en XY. Adipo-Clear offre une visualisation tridimensionnelle des tissus adipeux, apportant une compréhension plus approfondie de leur morphologie et de leur structure par rapport aux méthodes d’histologie traditionnelles (Chi et al., 2018a).
La délipidation est une étape cruciale de la méthode Adipo-Clear. Lorsqu’elle est insuffisante, elle peut entraîner des images floues, en particulier vers le centre du tissu. Par ailleurs, cette approche présente des limites pour l’imagerie de signaux denses. Lorsque des anticorps sont utilisés pour marquer des signaux denses, ils peuvent être captés par les épitopes situés à la surface de l’échantillon, empêchant ainsi l’accès aux structures internes des tissus. Pour cette même raison, l’application de la méthode Adipo-Clear sur le tissu adipeux brun reste limitée. Ce type de graisse, caractérisé par une structure dense, ne permet qu’une coloration en surface, rendant l’imagerie 3D inefficace pour visualiser l’intérieur du tissu (Chi et al., 2018a).
VII) Références bibliographiques
Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P.(2018a). Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. J Vis Exp. (137), e58271.
Chi, J., Wu, Z., Choi, C.H.J., Nguyen, L., Tegegne, S., Ackerman, S.E., Crane, A., Marchildon, F., Tessier-Lavigne, M., Cohen, P. (2018b). Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27, p226-p236.
Henriques, F., Bedard, A.H., Guilherme, A., Kelly, M., Chi, J., Zhang, P., Lifshitz, L.M., Bellvé, K., Rowland, L.A., Yenilmez, B., Kumar, S., Wang, Y., Luban, J., Weinstein, L.S., Lin, J.D., Cohen, P., Czech, M.P.(2020). Single-Cell RNA Profiling Reveals Adipocyte to Macrophage Signaling Sufficient to Enhance Thermogenesis. Cell Reports. 32, 107998.
