La biolistique, également appelée gene gun, est une méthode de transfert de gènes direct, notamment utilisée sur les cellules végétales (Tagu et al.,2018). Des micro-projectiles propulsés à haute vitesse introduisent des gènes d’intérêts dans les cellules cibles.
Cette méthode est à la fois utilisée en recherche pour étudier l’expression génétique de certains gènes (Hamad et al., 2020) par exemple, mais également pour la production de nouvelles variétés, en agriculture (Sobańska et al.,2019).
II.Principe
La biolistique consiste à projeter sur des tissus des micro-projectiles enrobés d'ADN à l'aide d'un canon à particules. Certains micro-projectiles pénètrent les membranes et arrivent dans le noyau. L’ADN transporté est libéré et peut être exprimé par la cellule (Tagu et al.,2018).
III. Mode opératoire
Dans un premier temps, les micro-projectiles en tungstène ou en or de 1 à 3 µm de diamètre sont enrobés avec l’ADN d’intérêt par précipitation en présence de chlorure de calcium et de spermidine, qui favorisent son adhésion à la surface des billes. Ces micro-projectiles servent ainsi de vecteur pour faire entrer le gène d’intérêt dans les cellules cibles (Tagu et al., 2018).
IV.Objectifs
La biolistique, également appelée gene gun, est une méthode de transfert de gènes direct, notamment utilisée sur les cellules végétales (Tagu et al.,2018). Des micro-projectiles propulsés à haute vitesse introduisent des gènes d’intérêts dans les cellules cibles.
Cette méthode est à la fois utilisée en recherche pour étudier l’expression génétique de certains gènes (Hamad et al., 2020) par exemple, mais également pour la production de nouvelles variétés, en agriculture (Sobańska et al.,2019).
V.Principe
La biolistique consiste à projeter sur des tissus des micro-projectiles enrobés d'ADN à l'aide d'un canon à particules. Certains micro-projectiles pénètrent les membranes et arrivent dans le noyau. L’ADN transporté est libéré et peut être exprimé par la cellule (Tagu et al.,2018).
VI. Mode opératoire
Dans un premier temps, les micro-projectiles en tungstène ou en or de 1 à 3 µm de diamètre sont enrobés avec l’ADN d’intérêt par précipitation en présence de chlorure de calcium et de spermidine, qui favorisent son adhésion à la surface des billes. Ces micro-projectiles servent ainsi de vecteur pour faire entrer le gène d’intérêt dans les cellules cibles (Tagu et al., 2018).
Ensuite, les micro-projectiles sont propulsés, soit suite à une explosion de la poudre contenu dans le pistolet à gènes (figure 1), soit suite à la détente d’un gaz sous pression, souvent l’hélium. Certains micro-projectiles entrent en contact avec la paroi cellulaire et ralentissent lors de leur passage à travers les différentes membranes végétales (Wellmann et al.,1999).
Ils peuvent atteindre aussi bien le cytoplasme que le noyau. Les micro-particules arrivant dans le noyau peuvent alors libérer l’ADN transporté, permettant ainsi l’expression du gène. Notons que la durée d’expression du gène inséré est variable (Tagu et al., 2018).
VII.Présentation des résultats
La biolistique est une méthode d’insertion d’un gène, mais elle ne permet pas d’évaluer immédiatement si elle a été efficace à court terme. Tout d’abord, l’utilisation de PCR ou d’un gène rapporteur permet de vérifier l’arrivée du gène dans la cellule cible (Wellmann et al., 1999). Ensuite, réaliser un Southern Blot confirme l’intégration stable du gène dans le génome hôte. Et enfin, un Western Blot ou une RTqPCR atteste l’expression du gène dans le tissu cible (Sobańska et al.,2019).
VIII.Interprétation des résultats
Une des principales méthodes pour visualiser l’insertion du gène d’intérêt est l'utilisation d’un gène rapporteur.
Figure 2 : Gènes rapporteurs EGFP (A et D) et lac Z (B et C) Wellmann H et al., 1999
Wellmann et al.(1999) utilisent deux gènes rapporteurs : GFP (figure 2.A et 2.D) et la lac Z (figure 2.B et 2.C). Le gène de la Green Fluorescent Protein est ajouté avec le gène d’intérêt et code une protéine fluorescente : GFP. Sous un microscope à fluorescence, le gène de la GFP permet de s’assurer de l’insertion du gène d’intérêt. Ils utilisent également un autre gène rapporteur : lac Z.
Le gène lac Z est inséré avec le gène d’intérêt et code l’enzyme β-galactosidase. En présence du substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside), la β-galactosidase le dégrade et libère un composé qui précipite en bleu. Ainsi, dans les deux cas, l’insertion et la détection du gène rapporteur permet de s’assurer de la bonne insertion du gène d’intérêt.
L'utilisation d’un gène rapporteur n’est pas l’unique solution pour s’assurer de l’efficacité de l’insertion du gène d’intérêt. Pour plus d'informations sur les autres méthodes, vous pouvez vous référer aux autres méthodes du wiki.
IX.Intérêts et limites
La biolistique est simple, rapide et efficace, surtout chez les végétaux. Cette méthode peut également être appliquée à tout organisme possédant un génome. Cependant, elle est souvent moins performante que d’autres méthodes comme la transformation bactérienne dans le cas des cellules animales[JF1] (Sanford, 1988).
De plus, elle repose essentiellement sur le hasard. En effet, il est nécessaire que les micro-projectiles atterrissent dans le noyau pour que cela fonctionne. Rappelons que le noyau de la cellule végétale mesure en moyenne 5 à 7 µm et que les micro-projectiles mesurent entre 1 et 3 µm. Les chances qu’un micro-projectile y arrive sont minces. De plus, il faut que le micro-projectile possède encore de l’ADN non altéré lors de la projection. Et pour finir, cet ADN, s’il s’intègre dans le génome, peut s’insérer n’importe où, y compris au milieu de séquences codantes qui seront alors endommagées, ou dans des zones inactives. Sachant que de trop nombreuses copies peuvent aussi être intégrées au génome de la cellule (Gallais, 2013).
X.Références bibliographiques
GallaisA (2013) De la domestication à la transgénèse-Évolution des outils pour l’amélioration des plantes, éditions Quae
Hamad MIK, Daoud S, Petrova P, Rabaya O, Jbara A, Melliti N, Stichmann S, Reiss G, Herz J, Förster E (2020) Biolistic transfection and expression analysis of acute cortical slices. Journal of Neuroscience Methods 337: 108666
Sanford JC (1988) The biolistic process. Trends in Biotechnology6: 299–302
Sobańska K, Cerazy-Waliszewska J, Kowalska M, Rakoczy M, Podkowiński J, Ślusarkiewicz-Jarzina A, Ponitka A, Jeżowski S, Pniewski T (2019) Optimised expression cassettes of hpt marker gene for biolistic transformation of Miscanthus sacchariflorus. Biomass and Bioenergy127: 105255
Tagu D, Jaubert-Possamai S, Méreau A (2018) Principes des techniques de biologie moléculaire et génomique, éditions Quae
Wellmann H, Kaltschmidt B, Kaltschmidt C (1999) Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun. Journal of Neuroscience Methods92: 55–64
