Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Objectifs
La Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) est une méthode d’analyse génétique utilisée pour la première fois en 1980 par Botstein et al. Elle permet de détecter le polymorphisme génétique inter- ou intra- espèce dans les régions codantes et non codantes (Rasmussen, 2012).
Cette technique est utilisée pour cartographier le génome humain, mais aussi pour réaliser des tests de paternité, ou encore diagnostiquer des maladies héréditaires, ou distinguer deux espèces de bactéries en comparant les ARN 16 S (NCBI, 2017).
Principe
Une différence de nucléotides entre séquences d’ADN est détectée grâce à la variation de longueur des fragments d’ADN après digestion de l’ADN par une enzyme de restriction (NCBI, 2017).
Cette méthode est donc basée sur la variation d’un nucléotide au niveau d’un site de restriction. Après extraction de l'ADN, celui-ci est digéré par une enzyme, et les fragments obtenus séparés les uns des autres par électrophorèse sur gel d'agarose. Une sonde marquée est alors utilisée pour révéler certains fragments d’ADN, ce qui nous permet de déduire des différences de nucléotides entre les séquences étudiées (Reshma et al., 2017).
Figure 1 : Principe de la RFLP. Source : d’après (NCBI, 2017)
Mode opératoire
1- Extraction de l’ADN génomique
La méthode classique consiste à lyser les cellules et précipiter les acides nucléiques en éliminant les molécules indésirables, telles que les protéines et les ARN (Shu et al., 2013)
2- Amplification de l’ADN génomique par PCR
Au cours de cette étape, la séquence d’intérêt, située le long d’ADN génomique, est amplifiée en chaîne par polymérase (PCR). Il faut bien choisir les amorces.
3- Vérification de l’amplification par électrophorèse suivie d’une révélation
Le produit de PCR est analysé sur gel d’électrophorèse pour vérifier l’amplification de la séquence d’intérêt.
4- Digestion enzymatique de l’ADN
Une enzyme de restriction est ajoutée aux amplicons pour couper à des endroits spécifiques. Si le site de restriction est intact sur la séquence analysée, l’enzyme réalise la coupure de l’ADN. Sinon, la séquence n’est pas coupée au niveau de ce site. On obtient ainsi des fragments de différentes tailles.
5- Séparation des fragments d’ADN par électrophorèse
Les fragments d’ADN de différentes tailles sont séparés par électrophorèse.
6- Révélation des fragments de la séquence analysée
Une sonde ou des sondes marquées capables de s’hybrider avec un ou plusieurs fragments d’ADN digéré sont ajoutées après dénaturation et transfert de l’ADN sur membrane. On révèle ensuite la présence des hybrides sur la membrane. Le polymorphisme est révélé par des différences de taille du ou des fragments observés (Sumathi et al., 2015).
Présentation des résultats
L’étape clé de la technique RFLP est la détection des variations de nucléotides entre séquences d’ADN à comparer. S’il y a polymorphisme pour le site de restriction étudié, on obtient des profils d’électrophorèse différents.
Prenons l’exemple d’un des travaux de recherche de G. Sumathi et son équipe en 2015. Les chercheurs ont amplifié le gène codant l’ARN 18 S de 5 poissons différents afin d’identifier leur appartenance à une même espèce ou non. Le résultat de digestion par l’enzyme SduI a donné le résultat suivant.
Figure 2 : Gel de polyacrylamide montrant les résultats de la digestion des fragments d'ADN amplifié de différentes espèces par l’enzyme SduI. Source : (Sumathi et al., 2015)
Interprétation des résultats
Lorsque la ou les bandes révélées sont les mêmes entre les individus, il y a absence de polymorphisme. Lorsque certaines bandes sont différentes, il y a un polymorphisme entre les individus au niveau d’un site de restriction de l’enzyme utilisée. L’hétérozygotie au niveau du site de restriction étudié pour un même individu peut être identifiée si les bandes associées à chaque forme sont connues.
Dans l’exemple pris ci-dessus, l’individu D présente une seule bande à la place des deux bandes observées pour les autres individus. L’enzyme Sdul n’a pas pu couper au niveau de son site de restriction, ce qui montre qu’il y a un polymorphisme sur le site du gène codant l’ARN 18S.
Intérêts et limites
La méthode RFLP permet la détection de polymorphisme dans les régions codantes et non-codantes du génome et prend en compte l’hétérozygotie la plupart du temps. Il s’agit d’une technique reproductible et elle permet une détection précoce des polymorphismes. Cependant, le polymorphisme est limité aux sites de restriction. De plus, la RFLP est coûteuse et lourde à mettre en œuvre.
Références bibliographiques
D. Botstein, R. L. White, M. Skolnick Et R.W. Davis. (1980). Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics. mai 1980. Volume 32, n° 3, 314‑331.
Henrik Berg Rasmussen (2012). Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-Amplified Fragments (PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis - Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting. Biochemistry, Genetics and Molécular Biology, Gel Electrophoresis- Principles and Basics, 315-3.
NCBI (2017). Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Dans : NCBI. [Consulté le 27 mars 2018]. Disponible à l’adresse: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techrflp/.
Silvester Reshma, Alexander Deborah, Anthony Ally C., Hatha, Mohamed (2017). GroEL PCR- RFLP – An efficient tool to discriminate closely related pathogenic Vibrio species. Microbial Pathogenesis. Volume 105, 196-200.
Changlong Shu, Dongming Liu, Zishan Zhou, Jilin Cai, Qi Peng, Jiguo Gao, Fuping Song, Jie Zhang (2013). An Improved PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Method for the Identification of cry1-Type Genes. Applied and Environmental Microbiology. Volume 79 (21) 6706-6711.
G. Sumathi, G. Jeyasekaran, R. Jeya Shakila, B. Sivaraman, G. Arunkumar, U. Manimaran, D. Sukumar (2015). Molecular identification of grouper species using PCR-RFLP technique. Food Control. Volume 51, 300-306.
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