La quantification protéique par l’acide bicinchonique (ou BCAssay) est une méthode qui permet de déterminer la concentration en protéines d’un échantillon par colorimétrie. L’équation de la droite donnant l’absorbance en fonction de la concentration pour chaque standard permet de calculer la concentration d’un échantillon à partir de son absorbance.
Cette technique est notamment utilisée avant la réalisation d’un western blot : les échantillons sont chargés de sorte qu’ils aient la même concentration. Une BC Assay est donc réalisée afin de diluer convenablement la solution protéique à l’aide des concentrations calculées à partir des données d’absorbance.
II - Principe
La méthode repose sur le fait que l’absorbance est directement proportionnelle à la concentration en protéines d’un échantillon. Or, en milieu alcalin, les ions Cu2+ sont réduits en Cu+ par les protéines de l’échantillon. Puis, l’ajout de l’acide bicinchonique permet la formation d’un complexe spécifique [Acide Bicinchonique/Cu+] qui prend une teinte violette dont le maximum d’absorption se trouve à 562 nm (Walker, 1994).
Figure 1 : Réactions chimique réalisée au cours du dosage colorimétrique entre protéines, ions cuivriques et BCA (Thermo Scientific, 2009)
III - Mode opératoire
Tout d’abord, une gamme de dilution d’Albumine de Sérum bovin (ABS) (initialement concentré à 0.5 mg/ml dans de l’eau) est réalisée.
Les standards sont les suivants :
Std 1 = 4 μl BSA + 16 μl miliQ H20
Std 2 = 8 μl BSA + 12 μl miliQ H20
Std 3 = 12 μl BSA + 8 μl emiliO. H20
Std 4: 16 μl BSA+ 4 μl miliO. H20
Std 5 = 20 μl BSA
Blanc = 20 μl miliQ H2O
Les différents échantillons sont déposés dans chaque puits en prenant soin de retirer les cônes entre chaque dépôt. Le facteur de dilution a été déterminé par une BCA dans laquelle il y aurait une gamme de dilution pour l’ABS et une autre pour l’échantillon en question : le facteur à prendre sera alors celui dont la couleur se situe dans la gamme de couleurs de l’ABS dans l’eau. Chaque échantillon est placé en duplicata dans les puits en prenant soin de les vortexer au préalable et de changer de cône. Une fois tous les échantillons chargés, la solution BCA est préparée en combinant la solution claire (BCA Reagent A à 4.9 ml) et la bleue (BCA reagent B à 100 μl). 200 μl de cette solution colorée sont déposés dans chacun des puits. La plaque est incubée à 37°C pendant 30 minutes, puis passée au spectrophotomètre. L’absorbance de chaque valeur permettra de déterminer la concentration de chaque échantillon à partir de l’équation de la droite d’étalonnage réalisée grâce aux standards.
IV - Présentation des résultats
Le lecteur de plaque (ou spectrophotomètre) donne des valeurs d’absorbance pour chaque puits. La valeur d’absorbance du standard 6 est soustraite (information background) à toutes les autres, puis la moyenne de chaque dépôt déposé en double est calculée. Ensuite, une droite est tracée en prenant en paramètre l’absorbance de chaque standard en ordonnée et leur concentration en abscisse. Puis, via l’équation de la droite, la concentration de chaque échantillon est obtenue ; une moyenne sera faite entre les duplicatas. Il ne faut évidemment pas oublier de prendre en compte la dilution effectuée au cours de l’expérience dans ses calculs.
Figure 2 : Présentation d’un résultat de BCA avec l’exemple de l’albumine de bovins (Andrew, 2018, résultats non publiés)
NB: Les résultats ne seront valables que dans la mesure où :
Le coefficient de corrélation de la droite d’étalonnage R² est supérieur à 0.90,
La différence d’absorbance entre les duplicatas d’un même échantillon est inférieure ou égale à 10%.
V - Intérêts et limites
Les avantages sont la rapidité et la simplicité, puisqu’elle peut être faite en une étape (30 minutes pour déposer les échantillons et 30 minutes d’incubation à 37°C), contrairement à la méthode de Lowry (autre méthode de quantification colorimétrique), qui elle en nécessite deux (Lowry et al., 1951 et Smith et al., 1985). Cependant, des interférences peuvent venir perturber les données d’absorbance de la solution : des substances réduisant le cuivre, des acides aminés et des réactifs chélatant le cuivre (production d’un couleur, donc manque de précision de la protéine utilisée). Néanmoins, la BC Assay serait plus tolérante face à la présence de composés qui seraient susceptibles de brouiller les résultats, contrairement à la méthode Lowry (Thermo Scientific, 2009).
En revanche, la fiabilité de cette méthode dépend fortement de la précision de l’utilisateur lorsqu’il réalise les dépôts et peut par conséquent manquer de précision selon la qualité des dépôts. Étant donné les réactifs utilisés, elle reste aussi coûteuse.
VI - Références bibliographiques
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, and Randall RJ. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1):265-75.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, and Klenk DC (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid, Anal.Biochem. 150 (1), 76-85
