Extraction des lipides totaux et transformation en ester méthylique
en vue d’une analyse d’acide gras en chromatographie gazeuse
I)I) Objectifs
L’objectif de cette méthode est de permettre l’extraction et la transformation des lipides totaux d’un échantillon afin de réaliser une analyse d’acide gras en chromatographie en phase gazeuse. A partir d’un échantillon biologique quelconque (tissu, lysat cellulaire, …), cette méthode permet la séparation et l’extraction des lipides totaux et leur transformation en ester méthylique, afin d’analyser qualitativement et quantitativement la nature des constituants. Cette analyse se base sur l’utilisation d’un étalon interne.
II)II) Principe
Les lipides à extraire de l’échantillon doivent être séparés des autres constituants comme les glucides ou les protéines. Pour une séparation simple et rapide, on utilise une des propriétés physicochimiques des lipides : leur hydrophobie. Grâce à l’utilisation de solvants organiques tels que l’hexane, l’isopropanol ou le pentane, mis en contact avec l’échantillon, les lipides vont être extraits des autres constituants par la formation de deux phases. La phase organique, ici, la phase supérieure, contiendra les lipides totaux et la phase aqueuse contiendra le reste des constituants.
Une fois les lipides isolés du mélange, des réactions chimiques de saponification, puis de méthylation vont être réalisées afin d’obtenir des esters méthyliques, qui sont facilement analysables en chromatographie gazeuse.
Afin de pouvoir quantifier la nature des acides gras de l’échantillon, l’utilisation d’un standard interne absent de l’échantillon est nécessaire. Le standard couramment utilisé est un acide gras saturé impair : l’acide heptadécanoïque (C17:0) ou l’acide tridécanoïque (C13:0).
III)III) Mode opératoire
L’échantillon en solution (lysat cellulaire, broyat de tissu solubilisé, …) est ajouté dans un tube à méthylation à bouchon fermé. La première étape est l’ajout d’une quantité connue et précise du standard interne. La quantité de standard à ajouter est fonction de la quantité estimée de lipides dans l’échantillon. Pour une quantification plus précise, il est nécessaire d’avoir une quantité de standard interne qui est du même ordre de grandeur que les acides gras majoritaires présents dans l’échantillon.
Une acidification de la solution est réalisée en ajoutant 1 mL de solution d’HCL 3M.1
Puis, 4 mL d’un mélange hexane / isopropanol (3:2 v/v) sont ajoutés. Une homogénéisation est nécessaire afin de bien séparer les constituants dans les phases. La solution est ensuite centrifugée (1100 g, 10 min) et la phase supérieure organique est prélevée et transférée dans un nouveau tube de méthylation. Cette étape d’extraction est répétée sur la phase aqueuse avec 2 mL d’hexane / isopropanol pour récupérer les lipides résiduels n’ayant pas été extraits.
Un lavage est effectué en ajoutant 2 mL de solution NaCl (0,9 %, v/v) puis on centrifuge (3 min, 1100 g) et la phase organique est récoltée. Une évaporation pour éliminer totalement les solvants est effectuée (sous flux d’azote, ou sous vide).
Ensuite, une étape de saponification est réalisée. 1 mL de NaOH 0,5M est ajouté avant la mise au bain-marie à 70°C pendant 20 min des échantillons. L’étape de méthylation passe par l’ajout d’1 mL de Boron trifluoride dans le méthanol (12 %, v/v). Une double extraction est de nouveau réalisée en utilisant 4 mL de NaCl (0,9 %, v/v) additionné de 4 mL de pentane. La phase organique est ensuite lavée avec 2 mL de NaCl (0,9%, v/v) et évaporée.
Les esters méthyliques obtenus sont solubilisés dans 150 µL d’hexane et peuvent être analysés en chromatographie gazeuse.
IV)IV) Présentation des résultats
Les esters méthyliques sont analysés en chromatographie gazeuse, couplée à un spectrophotomètre de masse par exemple2. On obtient un chromatogramme avec lequel on peut identifier et quantifier les acides gras de l’échantillon.
Figure 1 :Chromatogramme d’analyse de certains acides gras d’hépatocarninome humain, obtenu par chromatographie gazeuse. Chaque pic correspond à un acide gras, identifiés avec le spectre de masse (production personnelle).
V)V) Interprétation des résultats
Les acides gras présents dans l’échantillon sont identifiés grâce à leur temps de rétention et leur spectre de masse. Une comparaison avec des molécules de références pour les identifier est possible grâce à l’utilisation d’une banque. Pour certains acides gras polyinsaturés peu communs, il est parfois nécessaire d’effectuer des dérivations pour identifier spécifiquement la position des insaturations3, 4.
VI)VI) Intérêts et limites
Cette extraction de lipides suivie d’une préparation d’analyse en chromatographie gazeuse par transformation en ester méthylique permet une analyse fine des constituants en acides gras de l’échantillon. De plus, elle est qualitative et quantitative via l’utilisation d’un standard. Cependant elle ne permet pas d’identifier spécifiquement les classes des lipides totaux (phospholipides, triglycérides, esters de cholestérol, acides gras non estérifiés). Pour cela, une séparation des lipides totaux en fonction des classes est nécessaire par séparation en chromatographie sur couche mince.
VII)VII) Références bibliographiques
1. Rioux, V., F. Pédrono, H. Blanchard, C. Duby, N. Boulier-Monthéan, L. Bernard, E. Beauchamp, D. Catheline, and P. Legrand (2013) “Trans-Vaccenate Is Δ13-Desaturated by FADS3 in Rodents.” Journal of Lipid Research 54 (12): 3438–52.
2. Rioux, V., B. Choque, H. Ezanno, C. Duby, D. Catheline, and P. Legrand (2015) “Influence of the Cis-9, Cis-12 and Cis-15 Double Bond Position in Octadecenoic Acid (18:1) Isomers on the Rat FADS2-Catalyzed Δ6-Desaturation.” Chemistry and Physics of Lipids 187 (April): 10–19.
3. Guillou, H., V. Rioux, D. Catheline, J. N. Thibault, M. Bouriel, S. Jan, S. D’Andrea, and P. Legrand (2003) “Conversion of hexade- canoic acid to hexadecenoic acid by rat Delta 6-desaturase”. J. Lipid Res. 44: 450–454.
4. Christie, W. W., G. Dobson, and R. O. Adlof (2007). “A practical guide to the isolation, analysis and identification of conjugated linoleic acid.Lipids. 42: 1073–1084.
