Xénogreffe
de cellules cancéreuses humaines sur un embryon de poisson zèbre à 48h post
fécondation
I. Objectifs
Les traitements
anti-cancéreux sont nombreux, et leur variabilité inter-individu est forte. Un
traitement optimal pour une tumeur sur un patient ne le sera pas sur un autre
patient, ce qui entraîne souvent le test de plusieurs traitements lourds, avec
beaucoup d’effets secondaires, pour peu d’efficacité. Une piste intéressante consiste
à utiliser le poisson zèbre comme un avatar du patient. Des cellules issues de
la tumeur du patient sont prélevées par biopsie, puis injectées à des embryons
de poisson de 48 h, sur lesquels les traitements envisagés sont criblés. Il est
alors possible de déterminer quel traitement est le plus efficace de façon
personnalisée (figure 1).
Figure 1 : principe de
l’utilisation de l’embryon de poisson zèbre comme avatar du patient : prélèvement
des cellules cancéreuses issues de ce dernier, injection à un embryon de
poisson de 48h, et criblage de l’efficacité des différents traitements.
Pour
atteindre cet objectif, la maîtrise de deux méthodes est nécessaire. Premièrement,
il faut pouvoir cultiver les cellules issues de la tumeur du patient. Deuxièmement,
il faut mettre au point la méthode d’injection de cellules tumorales dans un
embryon de poisson-zèbre de 48 h, ainsi que le criblage des molécules sur ce
modèle. Notre travail portera sur cette seconde méthode.
II. Principe
Des cellules tumorales de lignées
immortalisées sont injectées dans des embryons de poisson zèbre de 48 h pour
étudier l’effet de différentes molécules sur le développement tumoral et
métastatique (hors gliome et leucémie) à 30h post injection. Des cellules
humaines très métastatiques (exemple : MDA MB 231) sont donc utilisées.
Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour mettre en évidence des molécules
avec un potentiel thérapeutique, ou pour acquérir une meilleure compréhension
des mécanismes de développement tumoral et métastatique. (Vlecken
and Bagowski, 2009).
Les résultats attendus sont une
modulation de la croissance tumorale et métastatique à 30h, en fonction de la
molécule testée.
III. Mode opératoire
Préparation
des cellules
Les cellules sont marquées par
fluorescence (calcéïne, lentivirus, …) et à 80% de confluence. Elles sont
décollées au Versène, puis re suspendues dans 50µL de PBS coloré au rouge
phénol.
La
xénogreffe
Les embryons déchorionés sont placés sur
un fond d’agarose dans des cuves à paraffine, puis de la tricaine (anesthésie)
et de la méthylcellulose sont ajoutées, pour éviter que les embryons ne
flottent trop. Le capillaire est "loadé" avec la solution de cellules
cancéreuses, puis une dose est injectée à l’aide d’un FemtoJet à chaque embryon
dans le canal de Cuvier (tronc veineux reliant la vascularisation du tronc et
le cœur, zone d’injection privilégiée pour l’étude du développement
métastatique).
Une fois l’injection terminée, des
images des tumeurs sont réalisées au microscope à fluorescence. Les embryons
présentant des cellules ayant migré sont écartés (migration non métastatique).
Pour les embryons restants, la molécule étudiée est ajoutée de façon exogène
(dans l’eau). Ils sont ensuite placés à 33,5°C pendant un temps T de minimum 30h,
temps auquel de nouvelles images sont réalisées : une de la tumeur
(exposition courte) et une des métastases éventuelles (exposition longue). Pour
chaque image de tumeur (à T0 et à T), la surface tumorale est mesurée grâce au
logiciel Archimed (ou ImageJ). Le ratio surface tumorale à T/surface tumorale à
T0 est calculé et le nombre de cellules qui ont migré pour chaque poisson à T
sont comptées.
IV. Présentation des résultats
Les résultats peuvent prendre deux
formes : nuage de points ou histogrammes. Dans les deux cas, ces graphes
sont accompagnés d’images. De plus, un test statistique de Student est réalisé.
Figure
2 : L’inhibition de
LINC00152 réduit la prolifération et l’invasion des cellules du poumon dans les
xénogreffes de poisson zèbre par stéréomicroscopie (Shen et al., 2020).
Illustration
d’unedes
façons de présenter les résultats obtenus pour la croissance tumorale avec la
technique de xénogreffe de cellules cancéreuses chez l’embryon de poisson zèbre
(nuage de points).
Figure
3 : Invasion,
dissémination et métastases des tumeurs T241-VEGF. Les longues flèches blanches
indiquent les tumeurs primaires, les courtes flèches blanches indiquent les
cellules métastatiques. (Lee et
al., 2009)
Illustration
de l’autre façon de présenter les résultats obtenus pour la croissance tumorale
et le développement tumoral avec la technique de xénogreffe de cellules
cancéreuses chez l’embryon de poisson zèbre (histogrammes).
V) Interprétation des résultats
Pour la
croissance tumorale
En comparant le ratio surface tumorale à
T/surface tumorale à T0 du traitement étudié avec celui du contrôle, conclure
sur l’effet de la molécule testée est possible. Un ratio supérieur à celui du
contrôle indique que la molécule d’intérêt stimule la prolifération cellulaire
et donc la croissance tumorale. Au contraire, un ratio inférieur à celui du
contrôle traduit une inhibition totale ou partielle de cette croissance.
Pour le
développement métastatique
Le principe de comparaison est le même,
sauf qu’ici le nombre de cellules qui ont migré est étudié. Ainsi, la molécule
d’intérêt peut stimuler ou inhiber la migration cellulaire in-vivo.
V) Intérêts et limites
Le principal modèle concurrent de
celui-ci est le modèle murin. Ils présentent tous deux un développement de
cancers spontanés et proches de ceux de l’homme (au niveau histologique et biochimique),
et un objectif de médecine personnalisée. Cependant, cette méthode est très rapide et donc très utile lorsque de nombreuses molécules doivent être criblées. Pour obtenir des
résultats, le modèle murin nécessite 2 à 6 mois, contre 2 à 3 jours pour le
poisson. De plus, les traitements sont administrables en exogène, limitant le nombre
d’injections.
L’élevage de souris est cher, et leur
injecter des cellules humaines nécessite l’absence de système immunitaire, ce
qui entraîne de forts coûts (pièce stérile, …) et beaucoup de contraintes.
L’élevage de poisson zèbre nécessite moins d’espace, et des coûts moindres.
L’injection se réalisant sur des embryons de 48h, le système immunitaire est
encore inexistant.
Pour l’étude de la croissance tumorale,
l’imagerie in-vivo est possible chez la souris, bien que plus coûteuse
que chez le poisson. Cependant, pour l’étude du développement métastatique, la
souris doit être sacrifiée, ce qui n’est pas le cas de l’embryon de poisson,
qui est transparent.
Cependant, le poisson zèbre a une
température de croissance optimale de 28°C, tandis que celle de nos cellules
est de 37°C. La croissance post-injection se réalise donc à 33°C, ce qui
ralentit le métabolisme des cellules humaines et accélère celui du poisson. De
plus, le poisson zèbre reste un modèle simplifié, et certains organes sont
absents ou moins complexes. Enfin, ce modèle n’est pas pertinent pour l’étude
de tous les cancers, notamment ceux liés au vieillissement (durée de vie courte
de l’animal).
VI) Références bibliographiques
Vlecken DH, Bagowski CP. (2009). LIMK1 and LIMK2 are important for metastatic
behavior and tumor cell-induced angiogenesis of pancreatic cancer cells. Zebrafish.
6(4):433-9.
Shen W, Pu J, Sun J, Tan B,
Wang W, Wang L, Cheng J, Zuo Y. (2020). Zebrafish xenograft model of human lung cancer for studying the
function of LINC00152 in cell proliferation and invasion. Cancer Cell
International. 20(1), 376.
Lee SLC, Rouhi P, Dahl Jensen
L, Zhang D, Ji H, Hauptmann G, Ingham P, Cao Y. (2009). Hypoxia-induced pathological angiogenesis
mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish
tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 106(46), 19485‑19490.
