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Systeme CRISPR-dCas9

 

I. Objectifs 

Le système « CRISPR-defficient Cas9 » aussi appelé CRISPR-dCas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) est une méthode dérivée de la technique d’édition génomique CRISPR-Cas9, où l’activité catalytique de Cas9 a été désactivée. Elle est souvent utilisée pour la visualisation de génomes, des manipulations épigénétiques, l’analyse de composition de chromatine, et trouve donc de nombreuses applications en recherche médicale (Anton et al., 2018).

Principe 

Les procaryotes possèdent un système de défense immunitaire adaptative basé sur des CRISPR-RNAs associés à des gènes Cas. Le système CRISPR/Cas a la fonction d’identifier une séquence cible et de guider les nucléases vers des acides nucléiques à lyser. Dans le cas de CRISPR-dCas9, le site catalytique de Cas9 est muté simultanément sur deux résidus spécifiques, ce qui entraîne l’inhibition de l’activité endonucléase de l’enzyme (Anton et al., 2018).

Pour illustrer une application du système CRISPR-dCas9, nous analyserons le cas du ciblage de translocation Ten-Eleven I (TET-I) par CRISPR-dCas9 pour la déméthylation sélective de l'ADN au niveau du promoteur de BRCA1. En effet, L’ADN sur-méthylé sur les gènes suppresseurs de tumeurs en lien avec l'extinction de la transcription est une caractéristique commune des cancers. Il existe des enzymes de déméthylation de la famille des dioxygénases des TET. Afin d’étudier le rôle des enzymes TET qui effacent les marques de méthylation, le domaine catalytique de TET-I (TET-I-CD) est fusionné à dCas9. Cette protéine combinée à des sgRNA (single RNA) permet de cibler le promoteur de BRCA1 (Breast Cancer 1), un gène suppresseur de tumeur. Ce gène présente une hyperméthylation sur son promoteur qui provoque l’extinction du gène dans le cancer du sein et de l’ovaire (Choudhury et al., 2019).

Mode opératoire

La fusion de la protéine avec la dCas9 se fait en assemblant séquentiellement les séquences codantes des protéines souhaitées grâce à des enzymes de restrictions et de ligations. Dans notre cas, les séquences de TET-I catalytic domain (TET-I-CD) associées à l’extrémité N-terminale de la dCas9 sont introduites dans un plasmide. La protéine dCas9 est marquée par le rapporteur fluorescent EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein). 

Deux protéines de fusion ont été synthétisées, TDE-I et TDE-II (TDEs), avec respectivement une absence ou une présence de séquence de liaison entre TET-I-CD et dCas9 (Figure 1a). L’expression des protéines TDEs dans des cellules HeLa est vérifiée par Western blot (Figure 1b). La protéine de fusion fait au total 269 kDa. 

Le plasmide est transfecté avec des sgRNA spécifiques à des séquences différentes (Figure 1c). Ils guident la dCas9 sur 4 loci du promoteur BRCA1, mettant en contact la protéine TET-I avec des cytosines méthylées différentes. Les positions favorisent la déméthylation d’un plus ou moins grand nombre de cytosines.

Enfin, une transfection du plasmide est réalisée pour contrôler son introduction dans les noyaux, ici, de cellules HeLa (Figure 1d) (Choudhury et al., 2019).

 

Figure 1 : Conception du système CRISPR-dCas9 pour le ciblage du promoteur BRCA1 par TET-I (Choudhury et al., 2019).

Présentation des résultats 

Le complexe TET-I-dCas9 va cibler des régions spécifiques du promoteur de BRCA1 grâce aux sgRNA sélectionnés (Figure 1c). L’enzyme TET-I-CD va alors se fixer aux cytosines méthylées et effectuer une déméthylation sélective de ces sites du promoteur de BRCA1 (Figure 2). La mise en évidence de la déméthylation des cytosines par le complexe se fera par mesure de l’activité transcriptionnelle du gène BRCA1, par PCR quantitative (qPCR).

Figure 2 : Représentation de la régulation positive de l’expression du gène BRCA1 par hydroxyméthylation spécifique des loci par le complexe TET-I-dCas9. (Choudhury et al., 2019).

 

Interprétation des résultats 

Le complexe TET-I-dCas9 déméthyle la cytosine lorsque celui-ci est transfecté avec les sgRNA 2, 3, 4, comme le montre l’expression du gène BRCA1 par rapport à l’expression du témoin. Le système dCas9-TET1 va se placer sur le promoteur, il réalise son rôle de transporteur avec précision (Figure 3a). La déméthylation qui se traduit par une hydroxylation de la 5-mC prouve la précision du système avec l’ARN guide 2 (Figure 3b).

 

Figure 3 : Effets du ciblage du promoteur BRCA1 par TET-I sur l’expression génétique et l’enrichissement en 5-hydroxyméthylation (5-hmC). (Choudhury et al., 2019)

a - L’expression du gène BRCA1 après traitement des cellules HeLa avec TDE-I et différents sgRNA a été  déterminée par qPCR. b - Le promoteur BRCA1 a été enrichi en 5-hmC après transfection des cellules HeLa avec TDE-I et le sgRNA-2. 

 

Intérêts et limites 

Cette méthode a l’avantage d’être peu coûteuse et facile à mettre en place. De plus, elle possède une grande efficacité et une certaine spécificité envers ses cibles. C’est un outil de grand intérêt dans la compréhension des dynamiques autour de l’architecture nucléaire lors des différenciations cellulaires et des cycles cellulaires. L’édition épigénomique basée sur CRISPR-dCas9 permettra à long terme d’identifier les voies de régulation de maladies causant des changements à partir d’effets indirects en pathologie humaine. (Anton et al., 2018)

Références bibliographiques 

Anton T, Karg E, Bultmann S. (2018) Applications of the CRISPR/Cas system beyond gene editing. Biology Methods and Protocols. 1–10.  https://doi.org/10.1093/biomethods/bpy002

 

Choudhury SR, Cui Y, Lubecka K, Stefanska B, Irudayaraj J. (2019) CRISPR-dCas9 mediated TET1 targeting for selective DNA demethylation at BRCA1 promoter. Oncotarget. 7(29):46545-46556. https://www.oncotarget.com/article/10234/text/