Le RNAscope est une méthode d’hybridation in situ permettant de visualiser, localiser et quantifier spatialement l’expression d’ARN cibles au niveau cellulaire, tout en préservant la structure tissulaire et en supprimant le bruit de fond. La méthode du RNAscope est actuellement la seule permettant de détecter et visualiser des ARN non codant dans le contexte cellulaire.
II)Principe
La méthode du RNAscope permet de visualiser la présence de n’importe quel type d’ARN dans n’importe quel tissu de n’importe quelle espèce (ou du moins, c’est ce qu’annonce ACD, l’entreprise qui détient le RNAscope). A l’aide de sondes fluorescentes préalablement conçues, cette détection peut se faire sur tout type d’ARN (même sur celui d’espèces peu étudiées).
Quelques exemples de molécules détectables par cette méthode : ARN très faiblement exprimés, nouveaux isolats de virus, ARN non-codant, ARN codant pour des récepteurs pour lesquels il n’existe pas de bons anticorps… (Advanced Cell Diagnostics, 2014a).
La quantification d’ARN par le RNAscope repose donc sur l’hybridation de cette molécule avec plusieurs paires de sondes spécifiques. Des marqueurs fluorescents se fixent ensuite à ces sondes, ce qui permet l’amplification du signal et la facilitation de l’observation de l’ARN.
Les échantillons subissent tout d’abord un traitement spécifique engendrant leur perméabilisation : cette étape est nécessaire afin de permettre l’hybridation des ARN aux sondes. Une sonde à ARN ainsi que des protéases sont ajoutées aux tissus ou cellules à étudier (Advanced Cell Diagnostics, 2014a).
Ces sondes, appelées sondes cibles Z, ont une partie “inférieure” complémentaire de la séquence des ARN dont la présence est à tester, et une partie “supérieure” constituée d’une séquence de 14 nucléotides. Les régions inférieures et supérieures sont séparées par la séquence d’espacement. Ces sondes forment des paires, dont les parties supérieures libres forment un site de fixation pour le préamplificateur de 28 bases (Advanced Cell Diagnostics, 2015).
Amplification
Seules les paires de sondes cibles Z seront reconnues par le préamplificateur, qui se fixe sur les deux régions supérieures adjacentes. Ce phénomène permet une certaine spécificité, puisque les sondes non appariées ne permettront pas au préamplificateur de se lier de façon suffisamment forte pour supporter la phase de lavage (Advanced Cell Diagnostics, 2014).
Une fois le préamplificateur fixé à la paire de sondes cibles Z, les amplificateurs peuvent se lier aux sites spécifiques de celui-ci. Enfin, des sondes marquées de fluorescence (molécules de fluorescence ou enzymes chromogéniques) se fixent sur les amplificateurs (Advanced Cell Diagnostics, 2015).
Visualisation
Un signal est visible dès que 3 couples de sondes cibles Z sont fixés à l’ARN cible. La méthode RNAscope produit cependant 20 couples de sondes cibles Z, afin d’augmenter la puissance du signal observé. La grande spécificité de ces sondes permet la distinction de différents sous-types de molécules (Advanced Cell Diagnostics, 2015).
Quantification
La quantification des ARN se fait soit manuellement avec le kit fourni par ACD, soit automatiquement avec le logiciel RNAscope SpotStudio Software.
L’évaluation manuelle du nombre d’ARN est semi-quantitative. Lors de l'interprétation de la coloration RNAscope, il est recommandé de noter le nombre de points par cellule plutôt que l'intensité du signal, car le nombre de points est corrélé au nombre de copies d'ARN, alors que l'intensité des points reflète le nombre de paires de sondes liées à chaque molécule.
Lorsqu’une quantification automatique est effectuée, une image du tissu est prise (par exemple par caméra microscopique), puis chargée sur le logiciel. L’utilisateur règle certains paramètres (identification de la cellule, diamètre du noyau, diamètre des points représentant les ARN, …). Le logiciel renvoie alors une image avec les cellules délimitées selon un code couleur correspondant au nombre de molécules d’ARN présentes dans la cellule, et un tableau de données avec le nombre d’ARN par cellule pour permettre un traitement statistique des données (Advanced Cell Diagnostics, 2014b).
Dans cet exemple, des coupes de foie de souris injectées à la Concanavaline A (modélisation d’une hépatite auto-immune) ont été traitées grâce à la technique du RNAscope. Deux sondes ont été utilisées sur chaque coupe. Le but de la manipulation était d’identifier les cellules productrices d’IL-18 dans le foie dans un modèle d’hépatite aiguë de cause auto-immune.
Figure 3 : Coupe de foie murin traité à la ConA, sonde A (fluorochromes bleu) : détection ARNm PECAM 1 (spécifique des cellules endothéliales), sonde B (fluorochromes rouges) : détection ARNm IL-18 (molécule d’intérêt) (Stosskopf, 2022)
Figure 4 : Coupe de foie murin traité à la ConA, sonde A (fluorochromes bleu) : détection ARNm Kératine 18 (spécifique des hépatocytes), sonde B (fluorochromes rouges) : détection ARNm IL-18 (molécule d’intérêt) G : lumière blanche, D : même image en lumière fluorescente, canal TRITC. (Stosskopf, 2022)
G : lumière blanche, D : même image en lumière fluorescente, canal TRITC. (Stosskopf, 2022)
V)Interprétation des résultats
(Lors de cette manipulation, nous n’avons pas eu accès au logiciel de quantification, donc seule la méthode manuelle semi-quantitative sera décrite ici.)
Localisation :
Sur la figure 3, les fluorochromes bleus (marquant les ARNm PECAM 1) et rouges (marquant les ARNm IL-18) ne sont pas colocalisés : les cellules endothéliales ne sont donc pas les cellules sources d’IL-18 dans le foie dans le modèle de la ConA.
Sur la figure 4, il apparaît une colocalisation des fluorochromes bleus (marquant les ARNm Kératine 18) et rouges (marquant les ARNm IL-18) : les hépatocytes sont donc responsables de la production d’IL-18 dans le foie dans le modèle d’hépatite induite par la ConA.
Plus généralement, la visualisation des tissus colorés grâce à la technique du RNAscope permet de localiser clairement un ARN d’intérêt, qu’il soit codant ou non. Plus précisément, l’utilisation de 2 sondes (test RNAscope en duplex) permet de localiser les cellules sources d’un ARNm d’intérêt.
Quantification :
Grâce à la grille de score ci-dessous fournie par le producteur du kit, il est possible d’évaluer semi-quantitativement et manuellement les ARNm présents dans les deux coupes de foie (Figures 3 et 4). L’ARNm PECAM 1 obtient un score de 3, l’ARNm Kératine 18 a un score de 4 et l’ARNm IL-18 obtient un score de 2. L’absence de témoin négatif rend ces résultats difficilement interprétables.
Figure 5 : Interprétation des résultats : quantification (manuelle) des ARN en fonction de la coloration (staining) de l’échantillon (Advanced Cell Diagnostics, 2015)
VII) Intérêts et limites
Cette méthode présente de nombreux intérêts : elle permet notamment la localisation et quantification de plusieurs ARN (quatre maximum) simultanément, même si l’ARN d’intérêt est faiblement exprimé dans le tissu. La technique du RNAscope étant une méthode très reproductible, elle permet des résultats plus fiables, et disponibles en 8 heures.
Cependant, cette méthode reste coûteuse, et la quantification manuelle peut être laborieuse et peu précise (dépendante de l’observateur). De plus, une utilisation de cette méthode in vivo est très limitée, voire impossible, puisqu’il faut nécessairement prélever un tissu d’intérêt à observer.
VII)Références bibliographiques
Advanced Cell Diagnostics (2014a) RNAscope® - a novel breakthrough RNA in situ hybridization platform.
