La méthode FUCCI, mise au point en 2008(Sakaue-Sawano et al., 2008), aussi appelée indicateur de cycle cellulaire basé sur l’ubiquitination fluorescente (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) est une méthode permettant de distinguer la phase G1 d’une cellule des phases S/G2/M (Yano et al., 2020). C’est une méthode qui permet l’observation dans l’espace et le temps des cellules grâce à un système de fluorescence. La couleur de la fluorescence dépend de la phase dans laquelle se trouve la cellule. Ainsi, les cellules apparaissent rouges/oranges lors de la phase G1 et vertes lors des phases S/G2/M (Zielke and Edgar, 2015). Cet outil est particulièrement utile dans la recherche en biologie cellulaire, permettant aux chercheurs d'étudier la dynamique du cycle cellulaire et la prolifération dans divers types de cellules, y compris les cellules cancéreuses.
FUCCI utilise des protéines naturellement présentes et essentielles dans le cycle cellulaire. Ainsi, les sondes fluorescentes rouges/oranges et vertes sont liées à des fragments de ces protéines, respectivement Cdt1 s’exprimant au cours de la phase G1 et la géminine s’exprimant durant les phases S/G2/M. (Tada, 2007) Lors de la transition entre la phase G1 et la phase S, pendant une courte durée, les deux sondes sont présentes et s’expriment, ce qui laisse apparaître une couleur jaune de façon très succincte (Zielke and Edgar, 2015).
Le système FUCCI se compose de deux sondes fluorescentes construites à partir de protéines fluorescentes de différentes couleurs, chacune fusionnée à un régulateur du cycle cellulaire : Cdt1 et la géminine (Zielke and Edgar, 2015).
Cdt1(Cdc10 dependent transcript 1) est un facteur de réplication se fixant sur le complexe ORC (Origin Recognition Complex), lui-même fixé sur l’ADN, durant la phase G1 du cycle cellulaire. Lorsque la phase S débute et que la réplication commence, une interaction entre Cdt1 et la géminine entraîne l’inactivation de Cdt1, qui sera par la suite dégradé par protéolyse. Pour ne pas interférer avec Cdt1 et lui permettre d’assurer son rôle, la géminine est inactive lors de la phase G1. Ainsi, Cdt1 s’exprime durant la phase G1, alors que la géminine est fonctionnelle durant les phases S/G2/M du cycle cellulaire (Blanchard, 2003). La Figure 1 illustre ces mécanismes.
Figure 1. Rôle de Cdt1 et de la géminine dans le cycle cellulaire (Blanchard, 2003)
Pour élaborer les sondes fluorescentes du système FUCCI, deux protéines fluorescentes sont utilisées : mKO2 (monomère Kusabira-Orange 2) et mAG1 (monomère Azami Green). mKO2 est fusionné à un fragment humain de la protéine Cdt1 (acides aminés 30 à 120), tandis que mAG1 est fusionné à un fragment humain de la géminine (acides aminés 1 à 110). Ainsi, lorsque les protéines Cdt1 seront fonctionnelles et actives, elles émettront respectivement une fluorescence rouge pendant la phase G1 ou une fluorescence verte pendant les phases S/G2/M. Les fragments de protéines humaines ont été choisis de sorte à ce que les sites actifs soient conservés et que le cycle cellulaire ne soit pas perturbé (Zielke and Edgar, 2015). Les sondes sont schématisées en Figure 2.
Les sondes peuvent ensuite être insérées dans les noyaux des cellules grâce à des vecteurs comme les lentivirus. C’est une technique très efficace qui a déjà permis d’obtenir des cellules exprimant les deux sondes à des niveaux équivalents (Sakaue-Sawano et al., 2008).
Figure 2. Composition des sondes fluorescentes utilisées dans la méthode FUCCI (Sakaue-Sawano et al., 2008)
Ainsi, la fluorescence des cellules change au cours du cycle cellulaire, ce qui permet de visualiser les différentes phases du cycle cellulaire. De plus, lors du passage de la phase G1 à la phase S, les deux sondes sont exprimées simultanément pendant une courte période, ce qui entraine momentanément l’apparition d’une couleur jaune. La figure 3 représente les couleurs et les sondes exprimées au cours du cycle cellulaire.
Figure 3. (a) Couleurs observées durant le cycle d’une cellule (Kaida and Miura, 2021) (b) Variation de la fluorescence des deux sondes au cours du cycle cellulaire (Zielke and Edgar, 2015)
Pour connaître le stade du cycle cellulaire à un instant T de chaque cellule présente dans une culture, il est possible d’avoir recours à la cytométrie de flux. La protéine mAG1 est excitée par des longueurs d’onde autour de 492 nm et émet à 505 nm. Quant à mKO2, l’excitation se
fait autour de 551 nm et l’émission autour de 565 nm. Grâce à ces longueurs d’onde, la cytométrie de flux permet de visualiser la quantité de cellule en phase G1, en phase S/G2/M ou même en transition entre les phases G1 et S. Un exemple de résultat obtenu par cytométrie de flux est représenté en Figure 4.
Figure 4. Résultats de la méthode FUCCI observés par cytométrie de flux (Sakaue-Sawano et al., 2008)
En revanche, pour observer l’évolution du cycle cellulaire d’une ou plusieurs cellules en temps réel, l’utilisation d’un microscope à fluorescence sera plus adaptée pour permettre la visualisation continue des cellules en temps réel. Un exemple de résultat obtenu par microscopie à fluorescence est montré en Figure 5.
Figure 5. Résultats de la méthode FUCCI observés par microscopie à fluorescence (Sakaue-Sawano et al., 2008)
L’interprétation des résultats sera permise par la couleur observée : une cellule exprimant une fluorescence rouge/orange est en phase G1 tandis qu’une fluorescence verte est significative des stades G2, S ou M. De plus, si l’on arrive à observer une fluorescence jaune, c’est que la cellule se trouve en phase de transition entre les phases G1 et S du cycle cellulaire.
L'utilisation de ces résultats et leur interprétation dépendent de la question de recherche abordée. Par exemple, si l'objectif est d'étudier l'effet d'un médicament sur la progression du cycle cellulaire, les résultats pourraient montrer des changements dans la durée de chaque phase du cycle cellulaire. En revanche, si l'objectif est d'étudier le cycle cellulaire des cellules cancéreuses, les résultats permettraient d’identifier une progression anormale du cycle cellulaire, qui pourrait être utilisée comme cible pour une thérapie anticancéreuse.
L'utilisation de la méthode FUCCI présente plusieurs avantages. Il s'agit d'une méthode non invasive pour l'imagerie des cellules vivantes, qui permet de visualiser les changements dynamiques dans la progression du cycle cellulaire. En outre, elle permet d'identifier les anomalies du cycle cellulaire, telles qu’un arrêt ou une accélération. Cela peut aider à comprendre les mécanismes sous-jacents de maladies telles que le cancer.
L'une des limites de la FUCCI est qu'elle ne fournit que des informations sur les phases du cycle cellulaire. Elle ne fournit aucune information sur les points de contrôle du cycle cellulaire. De plus, il peut être difficile de distinguer les phases S et G2 en utilisant la méthode FUCCI, car la fluorescence mAG1 est présente dans les deux phases. Une amélioration de la méthode FUCCI a été élaborée pour surpasser cette limite en utilisant des sondes de couleurs différentes liées à des protéines spécifiques de chacune de ces deux phases.
Blanchard J-M (2003) Des oncogènes aux régulateurs de la mitose : un changement de perspective dans notre vision des processus cancéreux. Med Sci (Paris)19: 187–199
Kaida A, Miura M (2021) Visualization of Radiation-Induced Cell Cycle Kinetics with a Fluorescent Ubiquitination-Based Cell Cycle Indicator (Fucci). In AS Coutts, L Weston, eds, Cell Cycle Oscillators. Springer US, New York, NY, pp 223–236
Sakaue-Sawano A, Kurokawa H, Morimura T, Hanyu A, Hama H, Osawa H, Kashiwagi S, Fukami K, Miyata T, Miyoshi H, et al (2008) Visualizing Spatiotemporal Dynamics of Multicellular Cell-Cycle Progression. Cell132: 487–498
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