Live-seq : Méthode de séquençage du transcriptome de cellules uniques
I)Objectifs
La méthode Live-seq est une méthode de séquençage du génome très peu invasive. Cette méthode a pour objectif de préserver les cellules pour permettre de suivre l’activité des gènes dans le temps (Papageorgiou, 2022). Elle repose sur la microscopie à force fluidique.
L’objectif du Live-seq est le séquençage du transcriptome de cellules uniques, plus précis que le séquençage de tissus composés de plusieurs types cellulaires (Schutz, 2017).
II)Principe
Cette nouvelle technologie de séquençage consiste à extraire de l’ARN messager (ARNm) d’une cellule sans le détériorer, en utilisant un microscope à force fluidique. Le profilage du transcriptome peut être alors obtenu par séquençage ARN tout en maintenant la cellule en vie (méthode de RNA-seq) (Papageorgiou, 2022).
III)Mode opératoire
1. La microscopie à force fluidique
En microscopie à force fluidique, la cellule est isolée et encapsulée dans une gouttelette d’huile contenant le GEM (Gel bead in EMulsion) grâce à un système combinant la microscopie à force atomique et des micro canaux à force fluidique extrêmement fins.
Cette gouttelette d’huile GEM est une bille composée :
- D’une séquence Poly T, qui grâce à sa complémentarité à la queue poly A, va pouvoir se fixer aux ARNm.
- De plusieurs UMI, étiquettes moléculaires permettant de détecter des erreurs d’amplifications,
- D’un bar-code, qui est unique à la bille en question. Ce bar-code, également unique à la cellule, permet une identification des ARNm (Schutz, 2017).
La technique d’extraction appelée FluidM consiste à prélever de très petite quantité cytoplasmique et ainsi prélever l’ARNm cytoplasmique sans détruire la cellule (Chen et al., 2022). Le but est de minimiser la perte ou la dégradation de l’ARNm prélevé (Figure 1).
Figure 1 (Chen et al., 2022) : Procédure d'échantillonnage Live utilisant FluidM (ici, appliquée sur des cellules préadipocytes brunes IBA). Les flèches blanches indiquent l'application d'une sous-pression ou d'une surpression. Les flèches noires indiquent la quantité de tampon et d'extrait dans la sonde. Barre d'échelle, 20 μm. (1) Pré Chargement du tampon, (2) Ciblage de la cellule, (3) Extraction et (4) Libération de l’extrait
2. Réaction de RNA-seq : la méthode Smart-seq
La méthode de séquençage de base utilisée est le Smart-seq (Figure 2). Une fois l’ARNm récupéré et polyadénylé, il est possible de le transcrire en ADNc via l’intervention d’une reverse transcriptase en présence de TSO (Template Switch oligo). Ce TSO est ensuite clivé de manière enzymatique (méthode du template switching). Par la suite, une PCR est utilisée afin d’amplifier cet ADNc. L’ADN amplifié est ensuite incubé avec des transposases afin de fragmenter les transcriptions complètes et d’y ajouter des adaptateurs (Trombetta et al., 2018).
Figure 2 (Trombetta et al., 2018) : Présentation des différentes étapes de la méthode Smart-seq
Le protocole a ensuite été adapté pour que 1 pg d’ARN total soit détectable. Ceci représente environ 10 % de l’ARN cellulaire total (Chen et al., 2022)
Enfin, après purification, chaque bibliothèque unicellulaire obtenue est codée par PCR et peut être séquencée par la méthode illumina (Schutz, 2017).
3. Création d’une bibliothèque
Après séquençage par illumina de l’échantillon, une librairie de gènes est créée. En analysant la composition en gènes des différentes cellules échantillonnées, une matrice d’expression est obtenue (Figure 3) et peut être représentée dans un graphique (Schutz, 2017).
Figure 3 (Schutz, 2017) : Exemple d’une matrice d’expression obtenue après séquençage illumina. Les valeurs du tableau correspondent à la quantité d’ARNm retrouvé par gène et par cellule
IV)Présentation des résultats
Par une analyse statistique d’analyse en composante principale, la méthode Live-seq permet d’obtenir un graphique où chaque point correspond à une cellule. Plus les points sont éloignés et plus ils possèdent des caractéristiques génétiques différentes (Schutz, 2017).
Figure 4 (Schutz, 2017) : Profil d’expression obtenu à partir de cellules du sang (après clusterisation des familles)
Différentes représentations peuvent être réalisées en fonction de l’objectif de l’expérience. Dans l’exemple ci-dessous, les résultats sont présentés dans une carte montrant la distance des codes-barres de suivi dans les cellules échantillonnées afin de pouvoir les comparer (École Polytechnique Fédérale de Lausanne, 2022).
Figure 5 (École Polytechnique Fédérale de Lausanne, 2022) : Carte thermique montrant la distance de Hamming des codes-barres d’échantillons de cellules
V)Interprétation des résultats
Les résultats peuvent être interprétés de différentes manières en fonction de l’objectif de l’expérience. Par exemple, le séquençage du transcriptome de la cellule peut être réalisé à plusieurs instants, permettant ainsi de suivre son évolution au cours du temps. Une comparaison des différentes cellules échantillonnées est également possible dans divers domaines d’application (notamment la médecine) (Chen et al., 2022).
VI)Intérêts et limites
Cette méthode permet en premier lieu de stratifier différents types et états cellulaires de divers échantillons. La cellule ayant été préservée lors de l’extraction de l’ARNm à l’instant t, il est donc possible de prélever à nouveau du matériel génétique au sein de la même cellule à l'instant t+1. L’évolution temporelle du transcriptome de la cellule est alors obtenue permettant ainsi de mieux comprendre les relations entre comportement moléculaire et phénotypique à un instant précis : il s’agit d’une analyse transcriptomique “temporelle” (École Polytechnique Fédérale de Lausanne, 2022).
Toutefois, la procédure de Live-seq n’est encore utilisée que pour des cultures cellulaires. Des travaux sont en cours pour pouvoir étendre sa capacité à d’autres champs d’application. Enfin, augmenter la capacité de détection de l’ARNm ou du pouvoir de résolution cellulaire permettraient d'accroître l'efficacité de la méthode (Chen et al., 2022).
VII)Références bibliographiques
Chen W, Guillaume-Gentil O, Rainer PY, Gäbelein CG, Saelens W, Gardeux V, Klaeger A, Dainese R, Zachara M, Zambelli T, et al (2022) Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells. Nature608: 733–740
École Polytechnique Fédérale de Lausanne (2022) Live-seq- sequencing a cell without killing it. RNA-seq
