Purification
de protéine par précipitation au sulfate d'ammonium.
I)
Objectifs
La méthode de précipitation de sulfate d’ammonium permet de
purifier une protéine spécifique à partir d’un mélange complexe en l’isolant.
Cette méthode sépare les protéines selon leur solubilité à l’aide d’un sel
qu’est le sulfate d’ammonium (Burgess, 2009).
II)
Principe
Le phénomène de précipitation des protéines repose sur
l’étude de leur solubilité en fonction de la concentration en sel. Les
protéines ont des solubilités différentes dûes à de nombreux paramètres, comme
la position des groupes polaires, le poids moléculaire, le pH et la température
de la solution (Duong-Ly et Gabelli, 2014). Le sel communément utilisé est le
sulfate d’ammonium car il est très soluble, et forme deux ions en solutions
(NH4+ / SO4 2-), considérés comme très fort dans la série de Holfmeister [Figure
1] (Wingfield, 2001).
Figure
1 : Série de Hofmeister du sulfate d’ammonium et conséquences sur les
effets de “salting-in” et de “salting-out” (Wingfield, 2001).
La solubilité d’une protéine dépend de la force ionique de
la solution dans laquelle elle se trouve (Wingfield, 2001). Dans une solution
aqueuse, les molécules d’eau sont liées entre elles par des interactions
hydrogènes. Lorsque du sulfate d’ammonium est ajouté, les ions perturbent les
liaisons hydrogènes entre les molécules d’eau. Les molécules d’eau libres
interagissent alors avec la protéine. Or, plus le nombre d’interactions entre
la protéine et le solvant est élevé, plus la protéine est soluble. A forte
concentration, il y a une compétition entre les interactions soluté - soluté
(ions - protéine) et soluté - solvant (ions - eau). L’interaction soluté -
solvant étant de plus en plus prévalente, les ions vont délaisser la protéine
et ôter la couche de solvatation, ce qui entraîne la précipitation des
protéines.
A faible concentration en sel, la solubilité de la protéine
augmente avec l’augmentation de la concentration en sel jusqu’à atteindre son
maximum. Ceci correspond à la solubilisation saline (« salting-in »). A forte
concentration en sel, la solubilité de la protéine diminue. Cela correspond au
relargage (« salting-out »)
[Figure 2]. Lors du processus de relargage, les protéines les moins solubles
précipitent en premier et inversement, ce qui permet de purifier la protéine
désirée (Duong-Ly et Gabelli, 2014).
Figure
2 : Solubilité en fonction de la concentration en sel. Le “salting-in” augmente la solubilité de la protéine à faible concentration
en sel. En augmentant la concentration en sel, la protéine précipite (Duong-Ly
et Gabelli, 2014).
III)
Mode opératoire
La solution contenant les protéines à purifier peut provenir
de différentes sources biologiques telles que des extraits cellulaires ou des
cultures de cellules. La concentration d'ammonium sulfate nécessaire pour
précipiter sélectivement les protéines d'intérêt est déterminée d’après les
tables de références de solubilité d'ammonium sulfate [Tableau 1].
Tableau
1 : Table de calcul indiquant la
quantité de sulfate d’ammonium à ajouter à la solution de protéine à purifier
(Wood, 1976).
La solution de protéine à purifier est préparée, dans un
tampon, selon la concentration souhaitée. En respectant les tables de calcul
[Tableau 1], le sulfate d’ammonium est ajouté lentement et mélangé à la
solution de protéines à purifier. Pour faciliter la dissolution du sulfate
d’ammonium, le mix peut être placé sur un agitateur magnétique.
Une fois la précipitation des protéines complète, une
centrifugation à 15 000 g pendant 20 minutes sépare le précipité de protéines
des autres composants en solution. Le précipité de protéines se trouve sous
forme d'un culot au fond du tube, et les autres composants constituent le
surnageant à éliminer.
Un lavage est effectué avec soit une solution d'ammonium
sulfate à une concentration plus élevée, soit avec un autre tampon approprié
pour éliminer les contaminants non spécifiques. En fonction du niveau de pureté
de protéine voulu, le lavage peut être répété plusieurs fois. Une nouvelle
centrifugation sépare le précipité lavé du tampon de lavage.
Le précipité de
protéines est généralement suspendu dans un tampon adéquat et stocké à -80°C
(Wingfield, 2001).
IV)
Présentation des
résultats
Le résultat obtenu est le précipité formé à partir de la
protéine d’intérêt. Une fois solubilisé, un échantillon de cette solution peut
être récupéré pour analyser la pureté et l’activité de la protéine purifiée à
l’aide de techniques telles que l’électrophorèse sur gel (SDS-PAGE) [Figure 3],
la chromatographie, la spectrophotométrie.
Figure 3 :
SDS-Page de l’ensemble des échantillons de précipité et de surnageant à
différentes concentrations de sulfate d’ammonium. La protéine d’intérêt est
indiquée par une flèche rouge. La concentration de la protéine augmente dans le
précipité et réduit dans le surnageant au fur et à mesure de l’augmentation de
la présence du sel.
V)
Interprétation des
résultats
En fonction de la méthode choisie pour analyser la pureté de
protéine, les résultats seront différents. La méthode la plus utilisée est
l’électrophorèse sur gel. Les protéines migrent sur un gel en fonction de leur
taille et de leur charge, ce qui permet de déterminer si la préparation
contient des impuretés ou des protéines de taille différente. Dans la Figure 3, dans un contexte d’SDS-Page la
protéine d’intérêt est indiquée par la flèche rouge, et est accompagnée de
nombreuses autres bandes qui pourraient être des contaminants.
VI)
Intérêts et limites
Le principal avantage de la méthode de précipitation au
sulfate d’ammonium est sa simplicité. Le processus est rapide et demande peu de
matériel, donc peu coûteux. Cette méthode est peu spécifique, donc elle
convient à une large gamme de protéines.
Cependant, son manque
de spécificité peut entraîner la précipitation de nombreuses protéines et de
contaminants, et être la cause d’une perte de rendement.
Afin d’obtenir une protéine hautement pure, il est
nécessaire de purifier à nouveau le résultat obtenu afin d’éliminer les
impuretés résiduelles, soit en renouvelant cette méthode, soit en la combinant
avec d’autres méthodes de purification de protéine.
VII)
Références
bibliographiques
Burgess RP. (2009). Protein precipitation
techniques. Methods in Enzymology.
463, 42-44.
Duong-Ly KC, Gabelli SB. (2014). Salting out of proteins
using ammonium sulfate precipitation. Laboratory
Methods in Enzymology. 541, 85-94.
Wingfield P. (2001). Protein precipitation using
ammonium sulfate. Current Protocols in
Protein Science. 13 (1), 59-65.
Wood W. (1976). Tables for the preparation
of ammonium sulfate solutions. Analytical
Biochemistry. 73 (1), 250-257.
