Le Recombineering
(homologous RECOMBInation-mediated
genetic engiNEERING) est une technique de génie génétique
permettant de créer des modifications génétiques précises in vivo. Elle
est basée sur des systèmes de recombinaison homologue.
Cette méthode peut
être utilisée pour la construction de knock-out, de délétions,
d'insertions, d’inversions, de mutations ponctuelles, de remplacements de
gènes. Le clonage de gènes, la construction de plasmides in vivo et le
marquage de gènes/protéines sont également possibles (Sawitzke
et al., 2023).
II) Principe
Le recombineering utilise des substrats d’ADN linéaires qui peuvent être double-brin (dsDNA), généralement sous la forme de produits PCR, ou simple-brin (ssDNA) (oligonucléotides synthétiques). Ces substrats contiennent la modification que l’on souhaite apporter et sont flanqués de courtes séquences homologues à l’ADN cible (30-50 bases). Ces substrats sont introduits dans des cellules exprimant des enzymes de recombinaison, pouvant être codées par des bactéries, bactériophages ou levures. Ces enzymes incorporent l’ADN linéaire dans la séquence cible, donnant ainsi des molécules recombinantes.
III) Mode opératoire
Il existe différents modes opératoires du recombineering, dépendants du but recherché.
Nous allons prendre ici comme exemple l’insertion d’un marqueur sélectionnable à l’aide du système de recombineering le plus utilisé, celui du bactériophage λ Red. Ce système est composé de 3 protéines : Gam, Exo et Beta.
Tout d’abord, l’ADN linéaire contenant la modification à apporter et les séquences homologues à l’ADN cible est généralement introduit dans les cellules par électroporation. Une fois dans la cellule, la protéine Exo se fixe sur l’ADN linéaire. Exo est une exonucléase 5′→3′ spécifique de l'ADN double brin qui va couper l’ADN de 5’ vers 3’, laissant des surplombs 3’ de chaque côté de l’ADN. La protéine β va se fixer sur l’ADN simple brin (les surplombs laissés) et favoriser l’appariement de ce brin d’ADN avec l’ADN cible homologue (figure 1) (Sawitzke et al., 2013a).
La protéine Gam inhibe l'exonucléase RecBCD d'E. coli, qui dégrade normalement l'ADNdb linéaire. Gam n'est pas absolument nécessaire à la recombinaison, mais elle multiplie par 20 la fréquence de la recombinaison de l'ADNdb.
Les clones recombinants sont sélectionnés (ex: sélection de clones antibiorésistants si le marqueur sélectionnable était un gène d’antibiorésistance) et confirmés par PCR (Sawitzke et al., 2013a).
Figure 1 : Schéma de l’insertion d’un marqueur sélectionnable à l’aide du système de recombineering du bactériophage λ Red
Ceci n’est qu’un exemple des modes opératoires possibles pour le recombineering. Chaque mode opératoire comporte cependant les six étapes suivantes (figure 2) (Sharan et al., 2009):
- Génération du substrat d'ADN linéaire : ADN double-brin ou simple-brin
- Mise à disposition des gènes de recombinaison : les gènes de recombinaison peuvent être introduits de différentes manières dans les cellules bactériennes où la recombinaison sera effectuée.
- Induction des gènes de recombinaison : dans le cas du système de recombinaison λ Red, celui-ci est induit en incubant la culture bactérienne à mi-log dans un bain-marie à 42°C en agitant à 200 tours par minute pendant 15 minutes. Immédiatement après l'impulsion thermique, les cellules doivent être placées dans une bouillie d'eau glacée pour un refroidissement rapide.
- Préparation de cellules électrocompétentes et électroporation du substrat d'ADN
- Croissance après électroporation
- Identification et confirmation des clones recombinants
La présentation des résultats varie selon l’objectif de la manipulation.
Pour démontrer l’efficacité du recombineering, une PCR, une digestion par des enzymes de restriction, une analyse par Southern Blot ou un séquençage peuvent être réalisés (Sharan et al., 2009).
V) Interprétation des résultats
Ici aussi l’interprétation des résultats dépend de la méthode choisie.
Les recombinants antibio-résistants sont d'abord sélectionnés par un test d’antibiorésistance approprié, puis analysés par PCR pour vérifier que l'insertion s'est faite au bon endroit et que les cellules ne sont pas diploïdes pour le locus. Dans certains cas, comme pour les plasmides à copies multiples, une analyse de restriction peut être utilisée pour confirmer les clones recombinants. Les Southern blots et le séquençage peuvent être utilisés pour analyser les recombinants BAC ou génomiques. En cas de mutation ponctuelle ou d'autre changement subtil, le séquençage de l'ADN doit être utilisé pour confirmer l'exactitude des recombinants (Sharan et al., 2009).
VI) Intérêts et limites
Intérêts :
- Le recombineering permet d'apporter des modifications génétiques rapides, précises et peu coûteuses à n'importe quelle séquence d'ADN (Sawitzke et al., 2013b)
- Le recombineering étant basé sur des homologies entre séquences, il permet de modifier n’importe quelle séquence avec précision sans avoir besoin de sites de restriction, contrairement aux autres méthodes de génie génétique (Sharan et al., 2009).
- Cette méthode permet également de faciliter les altérations génétiques sur de grandes molécules d’ADN. En effet, dans de grandes molécules, il peut être difficile de trouver des sites de restrictions uniques, ce qui complique la réalisation de ces tâches via les techniques de génie génétique classiques. Hors, comme dit précédemment, le recombineering peut se faire indépendamment des sites de restriction (Sawitzke et al., 2023).
Limites :
- Étant donné que de très courtes régions d'homologie suffisent pour la recombinaison, la manipulation de régions contenant des séquences répétitives peut s'avérer problématique (Sharan et al., 2009).
- Les produits recombinants peuvent occasionnellement subir des mutations, puisque la plupart des méthodes de recombineering se basent sur des produits amplifiés par PCR comme ADN substrat. Cependant, cela peut se vérifier par séquençage (Sharan et al., 2009).
- La séquence de la région cible doit être connue. Cependant, comme le génome entier de nombreux organismes a été séquencé, cela n'est pas une limitation pour la plupart des organismes couramment utilisés (Sharan et al., 2009).
VII) Références bibliographiques
Sawitzke JA, Barenghi A, Thomason
L, Costantino N, Court D (2023). Recombineering: A Modern Approach to Genetic Engineering. Reference
Module in Life Sciences. doi: 10.1016/B978-0-12-822563-9.00100-1
Sawitzke JA, Thomason LC, Bubunenko M, Li X,
Costantino N, Court DL (2013a). Chapter Seven - Recombineering: Using Drug
Cassettes to Knock out Genes in vivo. In J Lorsch, ed, Methods in
Enzymology. Academic Press, pp 79–102
Sawitzke JA, Thomason LC, Bubunenko M, Li X,
Costantino N, Court DL (2013b).Chapter Ten - Recombineering: Highly
Efficient in vivo Genetic Engineering using Single-strand Oligos. In J
Lorsch, ed, Methods in Enzymology. Academic Press, pp 157–177
