La méthode HCR RNA FISH (Hybridization Chain Reaction RNA Fluorescence In Situ Hybridization) est une technique de détection d’ARN in situ basée sur l’hybridation et l'amplification de sondes fluorescentes. Elle est caractérisée par une grande spécificité grâce à l’utilisation de sondes spécifiques et permet même de réaliser du multi-ciblage grâce à l'utilisation de différentes couleurs de fluorophores (Huang et al., 2023). De plus, la fluorescence des fluorophores présents sur les sondes est visible seulement lorsque les sondes sont hybridées, permettant ainsi la réduction des signaux parasites.
Cette méthode est utilisée pour l’étude de l’expression de gènes afin d’identifier où et quand est exprimé un gène. Elle peut donc être utilisée dans de très nombreux domaines comme les neurosciences, la cancérologie, la microbiologie ou encore la biologie du développement.
II) Principe
Cette technique utilise deux types de sondes : des sondes initiatrices et des sondes d’amplification. Les sondes initiatrices sont designées pour se fixer spécifiquement à l’ARN cible. Une fois hybridées avec l’ARN, débute la phase d’amplification du signal : leur extrémité libre peut s’apparier avec les sondes d’amplification, qui s’assemblent ensuite en chaîne par hybridation successive. Ces sondes d’amplification h1 et h2, initialement en épingle et préalablement marquées par des fluorophores, sont designées telles que l’extrémité 3’ de h1 soit complémentaire de l’extrémité 5’ de h2 et réciproquement, ce qui permet leur hybridation en chaîne. La fluorescence est activée par l’hybridation des sondes. La détection des cellules ou tissus dans lesquels l’ARN d'intérêt est produit est alors possible à l’aide d’un microscope à fluorescence.
Figure 1. : (from Choi et al., 2018). In situ HCR v3.0 using split-initiator probes. (A) HCR mechanism. Green stars denote fluorophores. Arrowhead indicates 3′ end of each strand. (B) Standard probes carry full HCR initiator I1 and generate amplified background if they bind non-specifically. Split-initiator probes P1 and P2 each carry half of HCR initiator I1 and do not generate amplified background if they bind non-specifically. (C) Two-stage in situ HCR protocol. Detection stage : probe sets hybridize to mRNA targets, unused probes are washed from the sample. Amplification stage: specifically bound probe pairs trigger self-assembly of a tethered fluorescent amplification polymer and unused hairpins are washed from the sample. Automatic background suppression throughout the protocol: any reagents that bind non-specifically do not lead to generation of amplified background. (D) Multiplexing timeline. The same two-stage protocol is used independent of the number of target mRNAs. HCR amplification is performed overnight for qHCR imaging and qHCR flow cytometry experiments (to maximize the signal-to-background ratio) and for 45-90 min for dHCR imaging experiments (to resolve individual molecules as diffraction-limited dots).
III) Mode opératoire
L’échantillon est d’abord fixé pour préserver sa morphologie et ses composants biologiques, puis perméabilisé pour faciliter la diffusion des réactifs. Après une étape de pré-hybridation pour bloquer les sites non spécifiques, les sondes HCR™ HiFi complémentaires à l’ARN cible sont hybridées. Les sondes non fixées sont ensuite éliminées par lavage. L’échantillon est préparé pour l’amplification avec un tampon spécifique, puis les amplificateurs HCR™ Gold (hairpins h1 et h2) sont ajoutés pour générer un signal fluorescent. Un second lavage élimine les amplificateurs non liés. Une contre-coloration optionnelle (DAPI, Hoechst) permet de marquer les noyaux. L’échantillon est enfin monté entre lame et lamelle et imagé par microscopie à fluorescence (Molecular Instruments, 2025).
IV) Présentation des résultats
Les résultats sont des images de microscopie à fluorescence.
Figure 2 : Image au microscope à fluorescence d’un embryon de Drosophila, avec la région antérieure à gauche et postérieure à droite. Les ARNm du gène shavenbaby (svb) sont marqués par HCR RNA FISH en magenta et les noyaux des cellules sont colorés en blanc par DAPI.
V) Interprétation des résultats
Cette méthode permet à la fois une analyse qualitative, avec localisation des cellules où l'ARN cible est exprimé, et une analyse quantitative car l'intensité de la fluorescence est directement liée à la quantité d’ARN cibles.
VI) Intérêts et limites
Les intérêts de cette technique sont une visualisation directe des ARN in situ avec un grande spécificité ainsi que la localisation et quantification de plusieurs ARN simultanément (Huang et al., 2023). De plus, par rapport à une méthode RNA FISH classique, elle a l’avantage de ne pas utiliser d’anticorps.
Les limites de cette technique sont les mêmes qu’une méthode RNA FISH classique (cf wiki FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)). La fluorescence est sensible à la lumière et limitée dans le temps car son intensité diminue avec le temps. L’observation doit donc être faite rapidement après le montage. Cette technique reste chère, car il faut se procurer les sondes spécifiques aux régions à tester. Enfin, cette méthode est difficile à appliquer in vivo.
VII) Références bibliographiques
Choi HMT, Schwarzkopf M, Fornace ME, Acharya A, Artavanis G, Stegmaier J, Cunha A, Pierce NA. (2018). Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.Development 145 (dev165753).
Huang T, Guillotin B, Rahni R, Birnbaum KD, Wagner D. (2023). A rapid and sensitive, multiplex, whole mount RNA fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry protocol. Plant Methods 19, 131.
