La mesure de la concentration en protéines dans des échantillons est une partie essentielle de l’enzymologie ou de la biologie moléculaire. Ainsi, des méthodes de dosages rapides, sensibles et fiables sont nécessaire. Le dosage de protéine par la méthode de Bradford permet de mesurer la concentration totale de protéines dans un échantillon en utilisant le colorant bleu de Coomassie G-250.
II)Principe
Le dosage repose sur la liaison du colorant bleu de Coomassie G-250 aux protéines présentes dans l’échantillon, ainsi que sur son changement de couleur. Le colorant bleu de Coomassie change de couleur en fonction des paramètres du milieu : bleu sous sa forme anionique, vert à l’état neutre et rouge sous sa forme cationique (Figure 1).
Figure 1 : Formule du bleu de Coomassie G-250 ainsi que la représentation de sa couleur en fonction de sa charge globale
En solution acide, les protéines sont donc protonées, le colorant passe du rouge au bleu en se liant aux protéines à quantifier. Il forme des interactions hydrophobes et ioniques (Georgiou et al., 2008) avec les protéines. Cette liaison provoque un déplacement du maximum d’absorption de 465 à 595 nm, et c'est l'augmentation de l'absorbance à cette longueur d’onde qui est mesurée (Bradford, 1976).
III)Mode opératoire
Préparation du réactif protéique :
Le Bleu de Coomassie G-250 est dissous dans de l’éthanol à 95 %, puis mélangé avec de l’acide phosphorique à 85 % pour former le réactif. Ce dernier est ensuite dilué jusqu’à un volume final de 1 litre, fournissant un réactif à concentration finale de 0,01 % de Coomassie G-250, 4,7 % d’éthanol, et 8,5 % d’acide phosphorique.
Méthode standard : (pour des échantillons contenant de 10 à 100 µg de protéine)
Des échantillons de protéines sont préparés dans un volume maximal de 0,1 ml, ajusté avec le tampon approprié. Un volume de 5 ml de réactif protéique est ajouté, et le mélange est homogénéisé par inversion ou vortexage.
L’absorbance à 595 nm est mesurée après 2 minutes et avant 1 heure, dans des cuvettes de spectrophotomètre, contre un blanc de réactif préparé avec le même tampon et le réactif protéique. La relation entre la quantité de protéine et l’absorbance obtenue permet de construire une courbe d’étalonnage utilisée pour quantifier les protéines dans des échantillons inconnus.
Méthode micro-protéine : (pour des échantillons contenant de 1 à 10 µg de protéine)
Pour ces échantillons, le volume est ajusté à 0,1 ml avec le tampon approprié et un volume de 1 ml de réactif protéique est ajouté et mélangé.
L'absorbance à 595 nm est mesurée, et une courbe d’étalonnage est utilisée pour quantifier la protéine.
IV)Présentation des résultats
Dans un premier temps, une gamme étalon doit être effectuée. Cette gamme est préparée avec des échantillons de différentes concentrations connues en protéines connues. L’absorbance est mesurée à 595 nm avec un spectrophotomètre (Figure 2).
Figure 2 : Résultat de la coloration d’une gamme d’étalonnage par la méthode de Bradford
Ces valeurs sont intégrées dans un graphique décrivant l’absorbance à 595 nm en fonction de la masse de protéine de chaque échantillon de la gamme. Cette courbe permet de déterminer l’équation de la fonction linéaire reliant l’absorbance à 595 nm et la concertation en protéine. Cette équation est sous la forme : y = ax + b, A (595nm) = a x concentration en protéine + b (Figure 3).
Figure 3 : Résultat de mesure d’absorbance de différents échantillons de protéine avec la méthode Bradford. (Bradford, 1976)
Ensuite, une fois cette équation obtenue, l’équation est appliquée aux échantillons dont la concentration en protéine est inconnue. Pour ce faire, il faut traiter ces échantillons avec le même réactif que la gamme et ensuite mesurer l’absorbance dans les mêmes conditions que la gamme d’étalonnage. Ainsi, une absorbance à 595 nm est obtenue pour ces échantillons.
V)Interprétation des résultats
La concentration en protéines des échantillons inconnues est donc obtenue grâce à l’équation obtenue avec la gamme d’étalonnage en utilisant l’absorption mesurée de ces échantillons. Il faut cependant que l’absorbance mesurée pour ces échantillons soient compris dans le domaine de linéarité.
La courbe d’étalonnage est linéaire sur une grande partie de la gamme. On peut donc mesurer des échantillons jusqu’à environ 100 µg de protéine.
VI)Intérêts et limites
Ce dosage, à la fois rapide et reproductible, permet une liaison quasi-instantanée du colorant aux protéines. Il se fixe au bout d’environ 2 minutes, avec une stabilité de la coloration pendant une heure. Il présente peu d’interférences avec les cations (Na⁺, K⁺) ou les glucides comme le saccharose. Bien que certains tampons alcalins puissent induire une légère coloration, l'utilisation de témoins appropriés permet d'assurer la précision de la mesure. Seules des concentrations élevées de détergents (SDS, Triton X-100) perturbent significativement l’analyse, tandis que les faibles quantités peuvent être neutralisées par des contrôles adéquats.
VII)Références bibliographiques
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248–254
Georgiou CD, Grintzalis K, Zervoudakis G, Papapostolou I (2008) Mechanism of Coomassie brilliant blue G-250 binding to proteins: a hydrophobic assay for nanogram quantities of proteins. Anal Bioanal Chem 391: 391–403
