La cytométrie de flux est une technique permettant la mesure de multiples caractéristiques physiques et chimiques de cellules biologiques dans des populations parfois hétérogènes et à l’échelle d’une seule cellule.
Les applications de la cytométrie de flux sont très variées : immuno-phénotypage, analyse de ploïdie, dénombrement de cellules, quantification de l’émission de GFP (Green Fluorescent Protein)…
2. Principe
Le cytomètre de flux réalise ces analyses en faisant passer une à une les cellules (jusqu’à plusieurs millier par seconde) à travers un faisceau laser et en capturant la lumière émise par chaque cellule en réponse. L’analyse statistique des données permet de reporter des caractères cellulaires comme la taille, la complexité, le phénotype, et l’état de santé d’une cellule par mesure de la lumière diffusée et de la fluorescence.
Voici une représentation simplifiée du cytomètre de flux. Les cellules passent une à une dans un tube et sont soumises à un laser. Plusieurs détecteurs interviennnent alors pour capter les informations relatives à la couleur de la lumière ré-émise par la cellule, à sa taille et à sa granulométrie et sa strucutre.
Lorsqu’une cellule passe à travers le laser, elle réfracte ou diffuse la lumière dans toutes les directions. Toutes les intensités détectées sont converties en voltage.
La quantité de lumière diffusée vers l’avant ou de faible angle lorsque le laser atteint la cellule est appelé « forward scatter ». Elle est proportionnelle à la taille de la cellule.
La quantité de lumière diffusée dans les grands angles lorsque le laser atteint la cellule est appelée « side scatter ». Elle est proportionnelle à la granulosité de la cellule.
Le « side scatter » permet donc de déterminer la complexité de la population, car des types de cellule différents auront une structure donc une granulosité différente.
Afin d’étudier d’autres caractéristiques cellulaires comme la survie, ou la sous-catégorie cellulaire à laquelle appartient la cellule, des anticorps labélisés avec de la fluorescence sont utilisés. Ainsi, dans la population hétérogène étudiée, certaines cellules seront plus lumineuses que d’autres en fonction de la caractéristique cellulaire spécifique du fluorochrome utilisé.
La fluorescence détectée est transmise au détecteur approprié suivant sa longueur d’onde. Là, elle est convertie en une amplitude de voltage proportionnel à la quantité de fluorescence émise. Plusieurs fluorochromes peuvent être utilisés en même temps à condition qu’ils soient compatibles, c’est-à-dire qu’ils aient une longueur d’onde d’excitation semblable mais une longueur d’onde démission différente.
On s’affranchit des chevauchements spectraux via la compensation réalisée en tout début d’expérience. Pour ce faire, on réalise une mesure avec des cellules marquées d’une seule couleur et ce pour chaque fluorochrome utilisé. Le logiciel du cytomètre peut alors soustraire pour un fluorochrome la fluorescence provenant d’un autre fluorochrome.
La technique du FRET entre deux fluorochores est possible : elle permet de bien séparer le spectre d’émission du spectre d’absorption, ou d’utiliser un laser qui n’exciterait normalement pas le fluorochore émettant en dernier.
4. Intérêts/Limites
La cytométrie de flux est une technique puissante pour l’étude de caractéristiques cellulaires variées à l’échelle d’une seule cellule. C’est cette possibilité d’analyses multiparamétriques qui constitue le véritable intérêt de la cytométrie de flux.
Elle est également réalisable dans un grand nombre de domaines.
Les études sont toutefois restreintes à des tailles cellulaires comprises entre 1 et 15 micromètres de diamètre. Mais des dispositifs spéciaux et coûteux permettent de s’intéresser à des cellules allant de 0,5 à 100 micromètres.
5. Expression des résultats
Les pulses obtenus doivent être convertis en données numériques. Cela peut être fait de trois manières différentes : on peut mesurer la hauteur du pulse, la surface sous la courbe et sa largeur. Suivant les cytomètres, la hauteur ou la surface est utilisée. La largeur est gardée pour la distinction entre les événements dus à une ou deux cellules.
Une fois que les données ont été mesurées, on peut utiliser des histogrammes ou des nuages de points pour les représenter. Pour observer les corrélations entre deux paramètres, les nuages de points sont à privilégier.
Ces graphiques peuvent avoir une échelle linéaire ou logarithmique. Pour éviter la compression sur l’axe des populations négatives pour un anticorps, l’échelle logarithmique est privilégiée. En revanche, pour des expériences mesurant la quantité d’ADN dans les cellules ou pour une gamme étroite de valeurs de fluorescence, la représentation linéaire permet de distinguer les différences plus subtiles.
Une échelle bi-exponentielle est utilisable : elle est logarithmique du côté droit et linéaire du côté gauche, c’est-à-dire du côté de l’ordonnée.
6. Interprétation des résultats
La fluorescence permet également de différencier les populations d’un échantillon en fonction de la réponse positive ou négative à un ou plusieurs fluorochrome.
On détermine alors toutes les caractéristiques physiques et chimiques des cellules qui nous intéressent au sein de la population de départ.
7. Bibliographie
Moldavan, A. Photo-Electric Technique For The Counting Of Microscopical Cells. Science 1934: 188-189
Davey H, Kell D. Flow cytometry and cell sorting of heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell analyses. Microbiol Rev. 1996;60:641-96
Kalejta R, Shenk T, Beavis A. Use of a membrane-localized green fluorescent protein allows simultaneous identification of transfected cells and cell cycle analysis by flow cytometry. Cytometry. 1997;29:286-91
Hwang K, Park C, Jang S, Chi H, Kim D, Lee J, et al. Flow cytometric quantification and immunophenotyping of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia. Ann Hematol. 2012;91:1541-6
