La méthode FISH est une méthode de cytogénétique permettant de détecter et de localiser des séquences d'ADN spécifiques sur un chromosome, des séquences d'ARN ou encore des protéines, directement au sein des cellules ou tissus étudiés. Les sondes utilisées sur l'ADN peuvent cibler les chromosome entier, le centromère, ou encre un locus particulier.
Cette méthode permet de faciliter le caryotypage, et est utilisée en médecine pour la détection de maladies génétiques, et en sélection, pour identifier les gamètes déséquilibrées. Elle peut également permettre de différencier les espèces, et donc identifier une bactérie à l'aide de son ADN.
II) Principe
L'hybridation in situ en fluorescence se réalise en mettant en contact des sondes spécifique aux séquences recherchées avec la séquence à tester. Une fois hybridées, les sondes sont repérées à l'aide d'un marqueur fluorescent, visible à l'aide d'un microscope adapté.
III) Mode opératoire
Tout d'abord, une sonde est préparée par constitution d'un brin d'ADN comportant des nucléotides modifiés. Elle doit être assez longue pour pouvoir s'hybrider avec la zone de l'ADN ou de l'ARN voulue, mais pas trop grande pour ne pas être un frein à l'hybridation. Les sondes peuvent être directement étiquetées par des fluorochromes, ou repérées plus tard par fixation d'anticorps flanqués de molécules fluorescentes ou encore à l'aide de la biotine.
Les cellules que l'on veut analyser sont ensuite fixées, puis mises en présence des sondes. L'ADN et les sondes sont dénaturés par chauffage, puis, lorsque la température redescend, ils s'hybrident. La solution est ensuite lavée plusieurs fois pour éliminer les sondes non hybridées. Si la reconnaissance des sondes se fait à l'aide d'anticorps, on mets alors les anticorps, qui se fixent aux sondes hybridées, et on effectue de nouveau des lavages pour éliminer le surplus d'anticorps. On peut ensuite observer les cellules à l'aide d'un microscope à épifluorescence, qui excite les molécules fluorescentes, qui sont émettent alors une lumière, visible au microscope. Il existe différentes molécules fluorescentes, et on peut donc repérer plusieurs sites en même temps, en utilisant des couleurs différentes par exemple.
IV) Présentation des résultats
Les résultats sont très visuels : ils consistent en une photographie (ou une vidéo si la cellule n'est pas fixée) sur laquelle on peut voir de différentes couleurs les zones d'intérêt.
Parfois, l'interprétation est très simple : lorsqu’il s'agit simplement de détecter la présence ou non d'une molécule, il suffit de regarder s'il y a fluorescence ou non.
Sinon, il faut analyser la photo obtenue : on peut pas exemple compter le nombre de chromosomes, repérer des translocations en remarquant une alternance de couleurs au sein d'un même chromosome, identifier les zones de chromatine, etc … Enfin des sondes spécifiques de locus peuvent être utilisées, et dans ce cas on peut déterminer s'il y a eu une mutation par délétion, lorsque la zone attendue ne présente pas de fluorescence.
VI) Intérêts et limites
L'avantage de cette méthode est qu'elle peut à la fois être réalisée sur des cellules fixées ou sur des cellules vivantes. De plus, la structure et l'organisation de la chromatine ne sont pas perturbées. Cette méthode permet la visualisation directe des chromosomes lors de l'interphase.
Le problème est que suite au traitement de la FISH, la cellule n'est plus viable. De plus, la fluorescence reste limitée dans le temps et l'analyse doit être faite rapidement, même si ce problème peut être contré par la prise de photo. L'analyse de résultats en deux dimensions peut limiter la vision et altérer les résultats. Enfin, cette technique reste chère, car il faut se procurer les sondes spécifiques aux régions à tester.
VII) Références bibliographiques
Polak, Julia M. and James O’D McGee. 1990. In Situ Hybridization: Principles and Practice. Oxford University Press, Oxford, pp. 10-30.
Schrock, E., et al. 1996. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science273, 494–497 doi:10.1126/science.273.5274.494
Dohm, Juliane C., et al. 2013. The genome of the recently domesticated crop plant sugar beet (Beta vulgaris). Nature 505 (7484): 546‑49. doi:10.1038/nature12817.
