EMSA – Le retard sur gel(Electrophoretic mobility shift assay)
I. Objectifs
Le retard sur gel (EMSA), décrit pour la première fois par Garner et Revzin, et Fried et Crothers en 1981, est utilisé pour détecter in vitro une interaction entre l’ADN et des protéines (facteurs de transcription).
II. Principe
La régulation de la transcription est réalisée par plusieurs protéines, liées directement ou indirectement aux régions régulatrices de l’ADN. Ces protéines sont appelées facteurs de transcription. Leur liaison aux promoteurs des gènes permet d’activer ou de réprimer leur expression.
La méthode plus utilisée pour étudier les liaisons « ADN–protéine » est l’EMSA. Elle est basée sur le fait que la mobilité électrophorétique du complexe « ADN–protéine » est différente de la mobilité de l’ADN « libre », générant donc une différence de taille entre les molécules libres et les complexes. Lors de l’électrophorèse, le mélange ADN–protéine est retardé (décalé = shift) sur le gel, par rapport à l’ADN seul.
III. Mode opératoire
L’expérience est réalisée avec des sondes d’ADN, marquées au phosphore radioactif (32P), et incubées avec la protéine dans un tampon approprié. Ce mélange est soumis à électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions non dénaturantes.
Les interactions détectées entre l’ADN et la protéine par l’EMSA ne sont pas nécessairement spécifiques. II faut donc faire des essais de compétition pour différencier la liaison spécifique de la liaison non spécifique. Deux sondes non radioactives sont utilisées : une des sondes est une séquence anonyme (compétiteur non spécifique) et l’autre sonde est la sonde originale non marquée (compétiteur spécifique ou sonde froide). Elle est ajoutée au mélange en quantités supérieures et croissantes par rapport à la sonde marquée (sonde chaude).
L’identité de la protéine qui forme le complexe peut être révélée grâce à des anticorps spécifiques dirigés contre les facteurs protéiques « suspects ».
IV. Présentation des résultats
Si la protéine se fixe effectivement sur le fragment d’ADN, la migration électrophorétique de ce dernier sera plus lente, et la bande correspondante migrera moins loin sur le gel que la bande correspondant à l’ADN pur.
V. Interprétation des résultats
Si l’interaction initiale entre la sonde marquée (chaude) et la protéine est spécifique, le compétiteur spécifique (froid) se liera au complexe et le bande lourde sur le gel s’estompera, puis disparaitra (Figure 1).
L’ajout d’un compétiteur non spécifique ne change pas l’apparence du complexe original, même en grandes concentrations.
L’ajout d’un anticorps spécifique de la protéine conduit à la formation d’un super complexe (supershift) dont la mobilité est encore plus faible, permettant de confirmer l’identité du facteur suspect.
Figure 1 : Interprétation du résultat après l’électrophorèse (Lin et Barbosa, 2002)
VI. Intérêts et limites
Avec certaines adaptations, la méthode peut aussi mesurer des paramètres cinétiques et évaluer la spécificité de l’interaction entre l’ADN et la protéine. Mutations et délétions peuvent être introduites dans les sondes pour vérifier quelles sont les bases importantes pour la liaison entre l’ADN et la protéine. Pour ces raisons, la méthode est de plus appliquée dans l’étude des interactions entre les éléments cis et trans.
Par contre, la méthode est très longue, laborieuse, et il faut avoir une grande quantité d’échantillon. Le principal inconvénient est la nécessité de manipuler des matériaux radioactifs Il faut avoir une formation spécifique, et être prudent avec le devenir des déchets et le stockage des sondes.
Pour réduire le temps, la quantité d’échantillon nécessaire et éviter le marquage isotopique, diverses méthodes ont été développées, utilisant la technique d’électrophorèse capillaire. Le CEMSA a permis d’éliminer plusieurs inconvénients de la méthode classique et il a l’avantage d’utiliser la fluorescence, et de permettre la détermination des constantes de liaison. Mais, les instruments nécessaires au CEMSA ne sont pas disponibles dans les tous laboratoires et il faut avoir une grande connaissance technique.
VII. Références bibliographiques
Fried M, Crothers DM. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res 1981;9(23):6505-25.
Garner MM, Revzin A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res 1981;9(13):3047-60.
HILLEBRAND, Sandro. Estudos de Reconhecimento biomolecular por eletroforese capilar. 2005. 81 f. Tese (Doutorado) - Curso de Ciências, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2005.
Jin CJ, Barbosa AS. Técnicas de Análise da Regulação da Transcrição Gênica e suas Aplicações na Endocrinologia Molecular. Arq Bras Endocrinol Metab vol 46 nº 4 Agosto 2002
