I.                  Objectifs

Les TALENs ou nucléases effectrices de type activateur de transcription sont des enzymes de restriction artificielles obtenues par assemblage d’un domaine de liaison à l’ADN appelé TALE (pour Transcription Activator-Like Effector), avec un domaine de clivage de l’ADN.

La combinaison de  ces deux domaines permet de générer des enzymes de restriction spécifiques de n’importe quelle séquence d’ADN et de modifier le génome des cellules dans lesquelles elles sont introduites.

II.               Principe

-          Domaine de liaison à l'ADN : TALE

Les TALE sont des protéines sécrétées par un pathogène des plantes : la bactérie Xanthomonas. Un TALE est constitué de séquences répétées en tandem. Chaque séquence répétée est constituée de 33 à 35 acides aminés très conservés à l’exception des acides aminés 12 et 13 (Repeat Variable Diresidue abrégé RVD) impliqués dans la reconnaissance et la fixation d’un nucléotide spécifique. En fait, chaque unité répétée va venir au contact d’un seul nucléotide, déterminé par le RVD : le 13ème acide aminé reconnaît le nucléotide tandis que le 12ème est impliqué dans la stabilisation de l’unité. (1)

 Figure 1 : Exemple d’association RVD-nucléotide fixé

-          Domaine de clivage de l'ADN

Le domaine de clivage de l’ADN est celui de l’endonucléase Fok1 qui fonctionne sous forme de dimère : elle nécessite en conséquence deux constructions avec des domaines de liaison à l’ADN dirigés contre des sites du génome, mais orientés dans des directions opposées (tête-bêche).

Figure 2 : Structure d’une TALEN (2)

Les TALENs grâce leur capacité à induire des cassures double brin de l’ADN, vont être utilisées pour réaliser des modifications du génome.

III.           Mode opératoire

1)      Assemblage du TALE et ligation du TALE au domaine de clivage

La synthèse artificielle du gène codant pour le TALE peut s’avérer problématique car les séquences répétées du TALE sont susceptibles de s'hybrider entre elles et de former des structures tige-boucle (ou épingles à cheveux).

 Figure 3 : Différentes méthodes d’assemblage du TALE (3)

A : Méthode Restriction Enzymes And Ligation- (REAL) associant les nucléotides deux à deux successivement après digestion par des enzymes de restriction.

B : Méthode Golden Gatecloning. Chaque nucléotide du TALE est flanqué par les sites de reconnaissance d’une endonucléase de type IIS.Les nucléotides du TALE s’assemblent en de petites séquences lors de la 1^ère étape. La seconde étape fait intervenir le site de reconnaissance d’une autre endonucléase de type IIS, et permet l’assemblage du TALE complet.

C : Assemblage Fast Ligation-based Automatable Solid-phase High-throughput (FLASH) utilisant d’une bille magnétique recouverte de streptavidine, et liée de manière non covalente à un adaptateur ADN marqué à la biotine (forme un complexe avec la streptavidine). La bille, grâce à l’adaptateur ADN fixe le 1^er nucléotide à la suite duquel vont s’ajouter successivement les autres nucléotides constitutifs du TALE.

Une fois le TALE construit, elle est combinée au domaine de clivage de Fok1. La TALEN ainsi obtenue peut être transférée dans la cellule cible.

2)      Transfection

Une fois l’assemblage des domaines réalisé, ils sont insérés dans des plasmides pour être transfectés par électroporation dans les cellules cibles, dans lesquelles les TALENs vont s’exprimer et accéder à la séquence d’ADN à cliver.

IV.           Présentation des résultats

Figure 4 : Les différentes possibilités d’édition du génome (2)

La réparation par jonction d'extrémités non-homologues peut induire des erreurs dans le génome par le biais d’indel (mutations décalantes)  susceptibles de rendre non fonctionnel le produit codé par le gène.

La recombinaison homologue va permettre l’insertion, l’invalidation (knock-out) ou encore le remplacement d’un gène (knock-in). Elle permet aussi de surexprimer un gène quand les TALENs sont couplées à un facteur de transcription (2).

V.               Intérêts et limites

Avant les TALENs, des nucléases à doigt de zinc (dont le fonctionnement ressemble à celui des TALENs avec Fok1 comme nucléase et les doigts de zinc comme domaine de liaison à l’ADN) étaient utilisées (3).

 L’intérêt des TALENs est leur plus haute spécificité (moins d’erreurs dans la reconnaissance des séquences spécifiques) et leur moindre cytotoxicité (4,5).

Cependant, les TALE peuvent reconnaître d’autres séquences et donc réaliser des modifications du génome non désirées. Bien que pratique et efficace, on va préférer aux TALENs la technique révolutionnaire CRISPR-Cas 9 qui est plus précise dans la coupure de l’ADN double brin. (cf wiki CRISPR-Cas 9 : https://tice.agrocampus-ouest.fr/mod/glossary/view.php?id=26265&mode=letter&hook=C&sortkey=&sortorder)

VI.           Références bibliographiques

1)      Deng D, Yan C, Pan X, Mahfouz M, Wang J, Zhu JK, Shi Y, Yan N. (2012). Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors. Science.335:720-723.

2)      Sun N. and Zhao H. (2013). Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs): A Highly Efficient and Versatile Tool for Genome Editing. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7):1811-1821.

3)      Carroll D. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics 188(4):773–782.

4)      Miller JC, Tan S, Qiao G, Barlow KA, Wang J, Xia DF, Meng X, Paschon DE, Leung E, Hinkley SJ, et al. (2011). A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29: 143–148.

5)      Ding Q, Lee YK, Schaefer EA, Peters DT, Veres A, Kim K, Kuperwasser N, Motola DL, Meissner TB, Hendriks WT, Trevisan M, Gupta RM, Moisan A, Banks E, Friesen M, Schinzel RT, Xia F, Tang A, Xia Y,Figueroa E, Wann A, Ahfeldt T, Daheron L, Zhang F, Rubin LL, Peng LF, Chung RT, Musunuru K, Cowan CA. (2013). A TALEN genome editing system for generating human stem cell-based disease models. Cell Stem Cell. 12:238–251.