La Méthode
formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE)
I)
Objectifs
La
méthode FAIRE est une méthode à haut-débit visant à isoler des régions
régulatrices de l’ADN. Cette technique a été mise au point par le laboratoire
de Jason D. Lieb [1],[2],[3] à l’Université de Caroline du Nord Chapel Hill.
II)
Principe
La chromatine qui se trouve dans
des zones de régulation présente une hypersensibilité du gène aux DNasesI. Cette
hypersensibilité reflète une perte ou une déstabilisation des nucléosomes. La
perte d’un nucléosome peut être directement due à la liaison d’une protéine
(facteur de transcription) et reflète une chromatine active. La méthode FAIRE est utilisée expérimentalement
pour identifier les régions régulatrices
[1],[2].
III)
Mode opératoire
a) Ajout
de formaldéhyde et sonication
Les
cellules sont mises en présence de formaldéhyde créant des liaisons covalentes
entre protéines et ADN. La sonication va permettre de couper les séquences
d’ADN [1].
b)
Extraction au phénol-chloroforme
L’extraction
repose sur la différence de solubilité des acides nucléiques et des protéines
dans une émulsion à deux phases. Le mélange de phénol et de chloroforme solubilise
les lipides et dénature les protéines, qui vont s’agréger dans la phase organique.
L’ADN hydrosoluble va rester dans la phase aqueuse. La présence de formaldéhyde
permet de conserver les liaisons ADN-protéine. Sans formaldéhyde, les protéines
se détacheraient de l’ADN au cours de l’extraction [1].
L’ADN
lié à des protéines va donc se situer dans la phase organique et l’ADN libre
dans la phase aqueuse. On considère que la majorité des protéines liées à l’ADN
correspond aux histones, protéines constitutives des nucléosomes. L’ADN de la
phase aqueuse correspond donc aux séquences régulatrices, comportant peu ou pas
de nucléosomes [1].
c) Hybridation sur puces à ADN
L’ADN
de la phase aqueuse est prélevé, amplifié par PCR quantitative, puis couplé à
un fluorochrome, et hybridé sur des puces à ADN [1].
Figure 1 : Les
différentes étapes de la méthode FAIRE
[1]
IV)
Présentation et
interprétation des résultats
L’analyse
des régions isolées par la méthode FAIRE peut se faire selon deux méthodes. La
plupart des études utilisent d’abord une méthode à haut débit de puce à ADN,
car c’est une méthode puissante, qui permet d’analyser un génome entier sans
avoir besoin de connaître les séquences à rechercher.
Le résultat final se présente sous la
forme de pics correspondant aux régions du génome dépourvues de nucléosomes, et
donc aux régions régulatrices de l’ADN. Une analyse par algorithme est
nécessaire pour trouver les pics significatifs.
Une vérification peut ensuite être
réalisée par qPCR, pour s’assurer que les pics obtenus correspondent bien aux
fragments d’ADN isolés par la méthode FAIRE, et non pas à des artefacts.
Le
résultat présenté sur la figure 2 [1] provient d’une culture de fibroblastes
humains. Les fragments d’ADN isolés sont tout d’abord amplifiés par PCR, puis
hybridés sur une puce à ADN. L’analyse par l’algorithme CHIPOTIe donne les
résultats ci-dessous.
Figure 2 : Résultats obtenus après la méthode
FAIRE sur des cellules fibroblastiques.
RNAP : ARN polymérase, TAF1 : transcription
initiation factor, H3-K4me et acétylation : méthylation des histones.
La méthode FAIRE permet d’identifier plusieurs
régions régulatrices sur le chromosome 19. Ici, l’expérience vise à confirmer
la fiabilité de la méthode. On compare les résultats avec des régions actives connues
(chromatine ouverte) du chromosome 19, comme des zones de transcription ou des
zones acétylées ou méthylées. Les pics obtenus par la méthode FAIRE
correspondent bien aux zones de régulations avérées du chromosome 19.
V)
Intérêts et limites
FAIRE est une
approche puissante pour détecter ex vivo
les éléments régulateurs fonctionnels dans les cellules des mammifères. Elle
implique peu de réactifs et se réalise en peu de temps.
Comparée à la méthode DNase-seq, la
méthode FAIRE est plus facile à mettre en œuvre. En effet, une perméabilisation des cellules n’est pas
nécessaire avant le traitement aux nucléases. De plus, une large gamme de temps
d’incubation (1,2, 4 et 7 min) à une unique concentration en formaldéhyde (1%)
est possible pour la même efficacité. Pour mener à bien la méthode DNase-seq,
la concentration appropriée en enzyme et le temps d’incubation doivent être préalablement
déterminés.
Enfin, FAIRE peut analyser n’importe quel
type de cellule : cellule sauvage, mutée, ou contenant des transgènes.
Il existe cependant des limites à cette
méthode. Chez l’Homme, la majorité des sites de régulation identifiés sont loin
du site de transcription. Cette distance ne permet pas de définir la
fonctionnalité du site de régulation isolé. En effet, il est impossible
d’identifier quel facteur de transcription se lie à cette région ou de déterminer
quel gène est régulé [2], [3].
VII) Références bibliographiques
[1] Giresi P.G.,
Kim J., McDaniell R.M., Iyer V.R., and Lieb J.D. (2007). FAIRE
(Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active
regulatory elements from human chromatin. Genome
Research. Volume 17(6). 877-885.
[2] Giresi P.G.,
and Lieb J.D. (2009). Isolation of active regulatory elements from
eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory
Elements). Methods. Volume 48(3).
233-239.
[3] Song L.,
Zhang Z., Grasfeder L.L., Boyle A.P., Giresi P.G., Lee B-K., Sheffield N.C., Gräf
S., Huss M., Keefe D., Liu Z., London D., McDaniell R.M., Shibata Y., Showers
K.A., Simon J.M., Vales T., Wang T., Winter D., Zhang Z., Clarke N.D, Birney E.,
Iyer V.R., Gregory E., Crawford, Lieb J.D
and Furey T.S. (2011). Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE
identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. Volume 21(10).
1757-1767.
