L’objectif de la chromatographie en phase liquide est de séparer les différentes molécules d’un mélange liquide afin de connaître sa composition ou dans un but préparatif, c’est à dire de purification de molécules.
II)Principe
A- Principe général
Le principe de la HPLC est, comme pour les autres variantes de chromatographie, d’utiliser les différences de propriétés physico-chimiques de différents composés pour les séparer. Un liquide, l’éluant, constitue la phase mobile, qui va entraîner plus ou moins facilement les molécules du mélange. Une phase dite stationnaire va permettre de séparer les solutés en interagissant avec eux. Cette phase stationnaire est composée d’un support de porosité variable recouvert d’un gel spécifique choisi en fonction des molécules à séparer. Le support se trouve sous forme de micro-billes maintenues dans la colonne.
B- Les différentes variantes de HPLC
L’utilisation de la HPLC par absorption est réservée à la séparation de molécules en fonction de leur polarité et de leur hydrophobie. Les solutés sont absorbés de manière différentielle par la phase stationnaire, selon l’intensité des liaisons faibles formées et leurs solubilités dans l’éluant. La résultante de ces deux forces (rétention et entraînement) cause la migration différentielle des composés qui peuvent ensuite être séparés.
Le principe de la HPLC de partage en phase inverse repose sur des greffes composées de longues molécules fixées sur le support par des liaisons covalentes. La phase inverse signifie que le solvant est plus polaire que la phase stationnaire, et les solutés sont séparés en fonction de leur hydrophobie. La greffe peut être par exemple des radicaux alkyles (chaînes C18). Selon les affinités des solutés pour la greffe, ceux-ci vont être entraîné par la phase mobile [1]. Il est possible de réaliser un gradient de force éluante en changeant les éluants utilisés pour pouvoir séparer des molécules très différentes.
La HPLC par échange d’ions vise à séparer des ions en se basant sur leur différence d’affinité pour une greffe ionique [2]. Ainsi, les ions du mélange vont se substituer aux ions de la greffe, puis après un changement d’éluant contenant un troisième type d’ions, vont être remplacés par ceux-ci. Ils vont donc migrer plus ou moins facilement et ainsi être séparés.
La HPLC par exclusion stérique vise à trier les molécules en fonction de leur taille. La colonne contient des billes de silices poreuses qui vont retenir les plus petites molécules et laisser passer les plus grosses. Cette technique est un bon moyen de récupérer les grosses molécules mais ne permet pas de purifier les petites qui restent coincées dans les pores des billes de silice [1].
La HPLC d’affinité est basé sur des interactions de type ligand-enzyme ou anticorps-antigène. Cette méthode est très utile pour séparer les protéines. Les molécules sont séparées en fonction de leur affinité pour le ligand greffé à la silice de la colonne [1].
III) Mode opératoire
L’échantillon liquide à analyser est placé dans un injecteur et envoyé dans la boucle d’injection. Après avoir été dégazé, l’éluant est pompé à son tour dans la boucle, grâce à des pompes constituées de saphir industriel (inerte et très dur), ce qui permet de délivrer un débit précis, constant voire élevé [1]. Ces pompes permettent de travailler en mode isocratique, c’est à dire avec un mélange d’éluants de composition constante, ou en mode gradient, autrement dit avec une variation linéaire de la composition du mélange d’éluants, ou par palier, si on le souhaite.
Figure 1: Schéma d’une boucle d’injection en phase d’injection et de balayage [5]
La boucle d’injection effectue une rotation entre les phases d’injection et de balayage pour un vidage plus simple de la colonne
Le mélange passe ensuite dans la colonne en acier inoxydable de quelques dizaines de centimètres de long pouvant supporter de fortes pressions. Elle est constituée de microbilles de silice greffées de molécules qui varient en fonction du type d’échantillon à analyser [1].
A la sortie de la colonne, les composés entrent en contact avec le détecteur à des temps différents. Le détecteur le plus utilisé en HPLC est un spectrophotomètre. Il est constitué d'une cuve à circulation en quartz, d'une capacité d'environ 10 µl, traversée en continu par un faisceau U.V. D’autres détecteurs utilisant la spectrométrie de masse, la fluorescence, ou l’indice de réfraction peuvent être utilisés [2]. Le signal généré par le détecteur est transmis au calculateur-enregistreur, qui va analyser et convertir les résultats pour les afficher sous la forme d’un chromatogramme.
Bien que le mode opératoire reste globalement le même, des catalogues répertorient les différents paramètres en fonction de la machine utilisée et de la nature des molécules de l’échantillon.
IV)Présentation des résultats
Le
résultat d’une HPLC est présenté sous forme d’un chromatogramme. L’abscisse
correspond au temps de rétention, et donc à la facilité avec laquelle la
molécule a traversé la colonne. C’est une constante pour une condition de
chromatographie donnée. L’ordonnée correspond quant à elle à l’intensité du
signal, c’est à dire à la quantité de la molécule détectée au temps t. On peut
donc en déduire la quantité totale de la molécule dans le mélange en calculant
l’aire du pic correspondant. Enfin, t0 correspond au temps de
rétention d’une molécule qui n’est pas retenue par la phase stationnaire.
Figure 2: Les différentes grandeurs d’un chromatogramme [1]
Abscisse : temps de rétention en minutes, ordonnée : intensité du signal; tr1 et tr2 sont les temps de rétention des composés respectifs, t0 est le temps mort, c’est à dire le temps de rétention d’un composé non retenu par la colonne) et ω1 et ω2 sont les largeurs des pics à leurs bases.
V)Interprétation des résultats
Chaque pic traduit la présence d’une molécule dans l’échantillon. Il est possible de quantifier les molécules en mesurant l’aire des pics. Il existe plusieurs méthodes pour approximer cette aire : soit par triangulation (figure 2), soit en reportant la valeur calculée automatiquement par la machine ou le logiciel. La proportion de chaque composé est déterminée par le rapport entre l’aire et la somme de toute les aires.
Le facteur de résolution permet de déterminer la significativité des résultats, il mesure la séparation des pics et permet d’évaluer la présence de chevauchement. Il vaut [1] :
où tr1 et tr2 sont les temps de rétention des composés respectifs, et ω1et ω2 sont les largeurs des pics à leurs bases.
V I )Intérêts et limites
La HPLC est une technique haute résolution et simple à mettre en œuvre, qui permet d’identifier et de quantifier de manière très précise les composants d’un mélange. Elle permet d’analyser tous les types de molécules tant qu’elles sont en phase liquide, et n’est pas limitée aux molécules volatiles comme la chromatographie en phase gazeuse. Elle permet aussi de purifier les produits en récupérant dans des tubes différents des composants en fonction du temps.
Cependant, cette méthode peut être onéreuse pour certains laboratoires. Le prix par échantillon est important (de l’ordre de 200 €) et est dû à la quantité d’éluant utilisé qui peut être de plusieurs litres. En effet, le débit de la phase mobile est de l’ordre de 5 ml/min, et la durée de l’analyse de l’ordre de l’heure [3]. 100 ml d’acétonitrile coûtent plus de 60€ et 100 ml de méthanol coûtent 50€ [4]. De plus, le prix des machines est conséquent à l’achat (40 000-50 000 € pour les plus simples) et à l'entretien. Cette technique est surtout consacrée aux molécules organiques solubles dans un liquide ou ioniques.
VII)Références bibliographiques
[1] CUQ J.-L. (2007). Cours sur la Chromatographie liquide. Université de Montpellier 2 science et technique.
Nous remercions Daniel CATHELINE, ingénieur de recherche au laboratoire de biochimie et nutrition humaine d’AGROCAMPUS OUEST pour le temps qu’il nous a consacré ainsi que pour ses explications sur la HPLC.
