Les plasmides bactériens sont
fréquemment utilisés lors du clonage de gènes. La technique de la
minipréparation permet d'extraire les plasmides des cellules bactériennes, afin
de les identifier, de les caractériser et de les manipuler. Les nouveaux
plasmides ainsi construits peuvent être isolés et caractérisés sur des gels
d'électrophorèse.
Il existe différentes méthodes de
minipréparation, telles que la technique par ébullition ou la technique en une
étape. La méthode par lyse alcaline est présentée ici. (Northrup et
al., 2010)
II)Principe
La minipréparation (ou miniprep) est
une technique de biologie moléculaire rapide et efficace, permettant d'extraire
de petites quantités d'ADN (de l'ordre d'1 microgramme d'ADN par millilitre) de
cultures bactériennes. Cette technique se base sur la dénaturation de l’ADN en
fonction du pH. Il existe une étroite plage de pH, comprise entre 12 et 12,5,
pour laquelle l’ADN linéaire est dénaturé, mais pas l’ADN circulaire. Grâce au
pH basique, le lysat (acide) formé lors de la lyse des bactéries est neutralisé,
et le pH reste stable afin de dénaturer uniquement l’ADN linéaire. (Birnboim et
Doly, 1979)
III)Mode opératoire
La première étape consiste à
cultiver les cellules contenant le plasmide d'intérêt, durant 16 h à 40 h.
Les bactéries sont ensuite lysées en milieu alcalin, dans
une solution de SDS (dodécylsulfate de sodium) et de NaOH (hydroxyde de
sodium), ce qui perturbe l'appariement des bases de l'ADN chromosomique et
entraîne leur dénaturation. Après neutralisation du pH de la solution par ajout
d’acétate de sodium ou de potassium, l'ADN plasmidique, qui est de petite
taille (de l'ordre du kilobase) peut rapidement se renaturer, alors que l'ADN
chromosomique ne le peut pas (sa taille est de l'ordre du mégabase). L’ajout de
SDS dans le milieu entraîne également la précipitation du complexe
SDS-protéines.
Une étape de centrifugation sépare l’ADN chromosomique,
l’ARN, les protéines et les débris cellulaires qui précipitent, de l'ADN plasmidique
qui reste dans le surnageant. L’ADN est ensuite précipité par l'éthanol,
conduisant à une quantité et à un degré de pureté d'ADN plasmidique suffisant
pour la plupart des applications en laboratoire.
Une des techniques fréquemment
utilisées en laboratoire est la digestion de l'ADN plasmidique par une enzyme
de restriction. L'ADN plasmidique isolé est analysé pour confirmer ou établir
son identité. Les molécules d'ADN digérées sont séparées par électrophorèse sur
gel d'agarose en fonction de leur taille. Pour améliorer cette étape, des
enzymes RNases sont ajoutées afin de détruire l’ARN contaminant. (Birnboim et
Doly, 1979; Northrup et al, 2010)
IV)Présentation des résultats
L’ADN plasmidique récupéré grâce à la miniprep peut être
analysé par électrophorèse après digestion par des enzymes de restriction.
La figure 1 est une photo d'électrophorèse prise après la
digestion par des enzymes de digestion d’un plasmide récupéré dans une bactérie
par la méthode de la mini-prep alcaline (dans le cadre du clonage d’un gène).
Le plasmide utilisé est le plasmide pgl3 d’une taille de 4 818 bp, et l’insert
introduit est d’une taille de 471 bp. (Northrup et
al., 2010)
Figure 1 : Photo d’électrophorèse du plasmide pgl3 contenu
dans des bactéries après minipréparation alcaline et digestion enzymatique
(UQAM, 2016)
V)Interprétation des résultats
Sur l'électrophorèse, on peut voir 2
bandes, l’une à 5 000 bp qui correspond au plasmide, et l’autre à 500 bp qui
correspond à l’insert. On peut conclure que la minipréparation à fonctionné et
que le plasmide a bien été extrait de la bactérie.
VI)Intérêts et limites
Les principaux intérêts de la minipréparation par lyse
alcaline sont sa simplicité, son efficacité et son faible coût. Toutefois,
cette technique connaît des limites.
Les impuretés les plus retrouvées dans la solution d'ADN
plasmidique purifié par miniprep sont les fragments d'ADN chromosomique. Du
fait de sa taille supérieure à celle de l'ADN plasmidique, l'ADN chromosomique
est fragmenté durant l'étape de lyse alcaline, ou par les forces de
cisaillement qui apparaissent lors du pipetage. Ces fragments, de l'ordre du
kilobase, précipitent avec l'ADN plasmidique, et peuvent se renaturer suite à
la neutralisation de la solution. Bien que la minipréparation soit utilisée
pour son efficacité et sa simplicité, l'ADN plasmidique n'est généralement pas
assez pur pour être utilisé dans des techniques sensibles, telles que le
séquençage d'ADN.
Également, cette méthode implique que l’ADN plasmidique
soit, comme l’ADN chromosomique, exposé à un pH alcalin. Or, une partie de
l’ADN plasmidique subit une dénaturation irréversible à un pH supérieur à 13. (Felicello et
Chinali, 1993; Chowdhury, 1991)
VII)Références bibliographiques
HC. Birnboim, J. Doly
(1979). A rapid alkaline
extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research, Volume 7, pages
1513-1523.
I.
Felicello, G. Chinali
(1993). A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified
plasmid DNA from Escherichia Coli. Analytical biochemistry.
Volume 2012 (tome 2), pages 394-401.
J.
Lemoine, UQAM (2016).Photo
électrophorèse du plasmide pgl3 contenu dans des bactéries après
minipréparation alcaline et digestion enzymatique(2016).
Unpublished
K.
Chowdhury (1991). One step
“miniprep” method for the isolation of plasmid DNA. Nucleic Acids Research. Volume 19, n°10, page 2792.
VA.
Northrup, CJ. Backhouse, DM. Glerum (2010). Development of a microfluidic chip-based
plasmid miniprep.Analytical Biochemistry. Volume
402, n°2, pages 185-190.
