SHERLOCK (Specific High Sensitivity Reporter unLOCKing) et DETECTR (DNA EndonucleaseTargeted CRIPR Trans Reporter) sont de nouvelles applications de la technologie CRISPR-Cas. Ce sont des outils de diagnostic basés sur une migration sur papier identifiant certaines signatures génétiques ou molécules cibles associées (Leitch, 2018)
II) Principe
Ces méthodes sont utilisées pour un diagnostic rapide. Cependant il faut avoir une connaissance de la séquence ciblée comme pour un CRISPR, il faut par exemple vérifier qu’elle est unique dans l’échantillon, afin de bien synthétiser l’ARN guide s’hybridant avec la cible.
SHERLOCK permet, par exemple, d’identifier la présence ou non d’ADN tumoral dans les cellules sanguines de patients atteints de cancer (Zusi, 2018), de quantifier le stade de contamination dans le cas d’un virus (Zusi, 2018) ou de vérifier la présence d’un gène bactérien codant pour une résistance aux antibiotiques, un génome viral ou une mutation causant un cancer (Leitch, 2018)
DETECTR possède le même principe de fonctionnement et a permis l’identification de différents types de Papilloma Virus (HPV), en détectant leur ADN dans les cellules humaines (Potenza, 2018).
III) Mode opératoire
Une étape préliminaire d’amplification isotherme par une polymérase recombinase (RPA) optimise le résultat de ces outils, en abaissant significativement la concentration minimale nécessaire à la détection de la cible. Cette étape va permettre l’hybridation des amorces avec la séquence cible, son élongation et son amplification à une température de 37-42 °C (Gootenberg et al, 2018)
La technique SHERLOCK utilise la technique CRISPR avec la protéine Cas13 qui coupe de l’ARN ou de l’ADN à un endroit prédéfini. Pour cela, un ARN guide d’une trentaine de bases est synthétisé. La protéine Cas 13 cherche la séquence complémentaire de cet ARN ou ADN dans l’échantillon et, lorsqu’elle la trouve, la coupe. Un reporter (ARN synthétique) est ajouté dans le mix et est coupé (activité RNAse) si Cas13 trouve la séquence cible. Une molécule signal est alors émise (par exemple fluorescente) pour confirmer sa présence (Figure 1) (Zusi, 2018).
Figure 1 : Schéma de fonctionnement de cas13a et de l’émission
du signal rendant compte du clivage de la séquence d’intérêt (Gootenberg et al,
2017)
Le principe de fonctionnement de DETECTR (Figure 2) est le même que pour SHERLOCK, mais la protéine utilisée est l’enzyme Cas12a, et la cible est de l’ADN. Lorsque cette protéine détecte sa séquence cible et la coupe, elle présente une forte activité DNAse. Cette dernière est non-spécifique et découpe les monobrins d’ADN présents dans l’échantillon. Ainsi, des molécules d’ADN synthétiques monobrins sont utilisées comme marqueurs fluorescents. Elles sont constituées d’éléments suppresseurs liés aux marqueurs et introduites dans l’échantillon. Lorsque Cas12a a reconnu sa cible, ces monobrins sont découpés et il y a émission de fluorescence (Leitch, 2018).
Figure
2 : Schéma de fonctionnement de la méthode DETECTR à l’échelle moléculaire
(Zusi, 2018)
IV) Présentation des résultats
Figure 3 : Photo présentant les bandelettes
de migration de la méthode SHERLOCK. A gauche, se trouvent les papiers sur
lesquels il n’y a pas eu de test effectué ; Au centre se trouvent les
bandelettes avec une mesure négative. Enfin à droite des bandelettes affichant
une mesure positive de la méthode SHERLOCK. (Zusi, 2018)
Figure 4 :
Identification des HPV type 16 et 18 dans des échantillons humains par PCR (à
droite) par DETECTR (à gauche) (Chen et al, 2018)
Les résultats sont visualisés sur papier. Dans le cas des bandelettes positives, on voit apparaitre une ligne. Celle-ci est beaucoup plus haut sur le papier par rapport au témoin pour SHERLOCK (Figure 3) ou fluorescente pour DETECTR (Figure 4) rendant compte de la détection de la molécule d’intérêt.
V) Interprétation des résultats
La présence d’une bande permet de savoir que la séquence cible a été reconnue par l’enzyme utilisée.
VI) Intérêts et limites
Ces outils de diagnostic sont faciles d’utilisation du fait qu’il n’y ait ni besoin de purifier, ni de dénaturer la séquence cible.
Elles sont assez sensibles du fait de l’étape préliminaire d’amplification et rapides (moins d’1h30 pour la détection couplée des virus Zika et de la Dengue en utilisant SHERLOCK) (Gootenberg et al, 2018).
Aujourd’hui, l’optimisation de l’utilisation des différentes enzymes Cas est en cours. En effet, l’étude des préférences de clivages de chaque enzyme Cas permettra la détection de plusieurs cibles à la fois dans le même échantillon. SHERLOCK deviendrait alors multiplexe.
De plus, SHERLOCK nécessite assez peu de matériel. Cas 13 peut être lyophilisé, et est donc facilement transportable. Il suffit de mélanger SHERLOCK à l’échantillon pour détecter la séquence cible (Gootenberg et al, 2018). Cela peut être pratique pour des détections de virus rapides dans des populations à risques comme en Afrique vis-à-vis de Zika.
Enfin, l’interprétation des résultats est très simple avec une lecture par présence ou non de bande.
CHEN, Janice S., MA, Enbo, HARRINGTON, Lucas B., DA COSTA, Maria, TIAN, Xinran, PALEFSKY, Joel M. et DOUDNA, Jennifer A.(2018) CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. In : Science. 15 février 2018. p. eaar6245. DOI 10.1126/science.aar6245.
GOOTENBERG, Jonathan S., ABUDAYYEH, Omar O., KELLNER, Max J., JOUNG, Julia, COLLINS, James J. et ZHANG, Feng(2018) Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. In : Science. 15 février 2018. p. eaaq0179. DOI 10.1126/science.aaq0179.
GOOTENBERG, Jonathan S., ABUDAYYEH, Omar O., LEE, JeongWook, ESSLETZBICHLER, Patrick, DY, Aaron J., JOUNG, Julia, VERDINE, Vanessa, DONGHIA, Nina, DARINGER, Nichole M., FREIJE, Catherine A., MYHRVOLD, Cameron, BHATTACHARYYA, Roby P., LIVNY, Jonathan, REGEV, Aviv, KOONIN, Eugene V., HUNG, Deborah T., SABETI, Pardis C., COLLINS, James J. et ZHANG, Feng(2017) Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. In : Science. 28 avril 2017. Vol. 356, n° 6336, p. 438‑442. DOI 10.1126/science.aam9321.
