Le pyroséquençage est une technique développée à partir de 1985 (1), permettant le séquençage de l’ADN (2). Cette méthode est principalement utilisée pour analyser les SNP (Single-nucleotidepolymorphisms) et ainsi permettre l'étude de la variabilité génétique et la détection d’haplotypes. Le pyroséquençage permet l'étude de la fréquence allélique dans de grandes populations, étant donné que les signaux obtenus par cette technique sont très quantitatifs. Une autre application de cette technique est aussi l’identification de bactéries, champignons, et de virus en vue de découvrir de nouvelles espèces, de nouveaux groupes taxonomiques, via le séquençage de l’ARNr 16S (1).
II) Principe
Cette technique est basée sur le principe de séquençage par synthèse, qui s’oppose au séquençage par “terminaison” qui est utilisé dans la méthode de Sanger. Le pyroséquençage repose sur une cascade de réactions (Figure 1). :
A l’issue de l’incorporation d’un nucléotide par la polymérase, un pyrophosphate (PPi) est relâché.
L’enzyme ATP sulfurylase utilise le PPi pour transformer l'adénosine phosphosulfate en ATP.
Cet ATP est ensuite utilisé par l’enzyme luciférase pour oxyder la luciférine, réaction qui produit de la lumière. L’intensité du signal lumineux est proportionnelle à la quantité de nucléotides identiques ajoutés.
Les nucléotides qui n’ont pas été incorporés dans la chaîne nucléotidique sont dégradés par l’enzyme apyrase ().
Figure 1: Principe du pyroséquençage(Ronaghi, 2001)
III) Mode opératoire
Avant d’effectuer le pyroséquençage, une PCR est réalisée de manière à obtenir un produit PCR biotinylé. Ce produit est ensuite des billes de Sepharose enrobées de streptavidine. Les billes sont lavées et dénaturé, ce qui permet d’obtenir de l’ADN simple brin adapté au pyroséquençage. L’ADN matrice est mis dans la plaque de réaction de pyroséquençage contenant l’amorce. Une fois que l’amorce s’est hybridée sur le brin d’ADN, la plaque est placée dans la machine de pyroséquençage PyroMark. Au cours du pyroséquençage, les réactifs (enzymes, nucléotides, substrat) sont ajoutés séquentiellement et à des volumes fixés. L’ensemble du processus est régi par un logiciel qui permet à la machine d’assurer les différentes étapes.
La machine Pyromark permet de séquencer simultanément jusqu’à 24 échantillons en moins de 15 minutes ().
IV) Présentation des résultats
Le capteur ChargedCoupledDevice (CCD) capte le signal lumineux émis par les luciférases, et le traduit par un pic sur le pyrogramme. La figure 2 montre l’intensité lumineuse relative détectée par le capteur à l’ajout du nucléotide indiqué en abscisse. Il est ainsi possible de connaître la composition de la séquence observée. Voici quelques exemples de pyrogrammes que nous expliquerons dans la partie V).
Figure 2: Exemples de pyrogrammes(Harrington et al., 2013)
V) Interprétation des résultats
Pour chaque salve de nucléotides correctement appariés, un pic est obtenu. Lorsque le nucléotide proposé n'est pas le bon, aucun signal n'est détecté. La hauteur de chaque pic est fonction de l'intensité du signal, et proportionnelle au nombre de nucléotides identiques détectés à la suite. Par exemple, dans le graphique A de la Figure 2, le brin codant comporte une Thymine et une Guanine à la suite. Ainsi, la proposition d’une Adénine, puis d’une Cytosineentraine l’émission de deux pics successifs de tailles identiques. Ensuite, étant donné que les bons nucléotides ne sont pas proposés (Thymine, Adénine), il n’y a pas d’émission lumineuse. Sur le graphique B de cette même figure, nous observons que la présence de deux Cytosines d’affilée entraîne la création d’un pic Guanine à l’intensité relative deux fois supérieure aux pics “simples”.
A partir du schéma du signal, la séquence étudiée peut être déduite.
La distribution de nucléotides sur le pyrogramme peut prendre deux formes : la distribution cyclique, ou la distribution optimisée. La distribution cyclique (Fig.2, graphique D) consiste à toujours proposer les nucléotides dans le même ordre (par exemple : AGCTAGCTAGCT...). La distribution optimisée (Fig.2, graphique C) n'a pas d'ordre particulier, mais est adaptée à la séquence étudiée. Or, la distribution cyclique ne permet pas de détecter les mutations complexes, ce qui risque de donner une séquence fausse. Les mutations complexes sont caractérisées par des mutations impliquant plus de deux bases substituées, et pas forcément consécutives. En revanche, elle est la seule option adaptée pour séquencer une cible inconnue, comme par exemple un génome entier. Ces deux techniques mènent donc à des pyrogrammes différents, bien que les séquences soient les mêmes (3).
VI) Intérêts et limites
Cette technique est utilisée dans le cadre de la détection de mutations (transformant ainsi des gènes sains en oncogènes, qui sont des gènes impliqués dans le développement de tumeurs), l’analyse de méthylation, ou encore l’analyse de résultats complexes issus de la méthode de Sanger. Dans le même temps, les pyrogrammes du Wild Type et du mutant sont réalisés, afin de repérer en temps réel les mutations entre les deux individus, sur la région d’intérêt.
Les intérêts de cette technique sont nombreux. Celle-ci ne nécessite aucun clonage, ce qui entraîne des gains de temps et aussi d'argent. Le pyrogramme peut être étudié en temps réel, ce qui permet la lecture directe de la séquence obtenue, et détecte plus facilement les allèles mutants que la méthode de Sanger.
En revanche, certains aspects pourraient encore être optimisés. Par exemple, si trop de nucléotides identiques se suivent, il devient difficile de les quantifier précisément. En effet, la taille du pic devient disproportionnée en comparaison aux autres pics environnants. De plus, le pyroséquençage ne lit que des séquences relativement courtes en comparaison avec la méthode de Sanger.
VII) Références bibliographiques
1 -AHMADIAN, Afshin, EHN, Maria et HOBER, Sophia, (2006). Pyrosequencing: History, biochemistry and future. In : Clinica Chimica Acta. janvier 2006. Vol. 363, n° 1‑2, p. 83‑94. DOI 10.1016/j.cccn.2005.04.038.
2 -HARRINGTON, Colleen T., LIN, Elaine I., OLSON, Matthew T. et ESHLEMAN, James R., (2013). Fundamentals of pyrosequencing. In : Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 2013. Vol. 137, n° 9, p. 1296–1303.
3 - F. SANGER, S. NICKLEN et A.R. COULSON,« DNA sequencing with chain-terminating inhibitors », Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, vol. 74, 1977, p. 5463-5467
4-RONAGHI, Mostafa, (2001). Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. In : Genome research. 2001. Vol. 11, n° 1, p. 3–11.
