Avant le développement de la technique de Recombinaison Cre-LoxP, la production de modèles vivants avec des gènes inactivés (Gene KnockOut) n’était pas possible si les gènes concernés étaient impliqués dans le développement embryonnaire. Il était également impossible de réaliser un KO dans un tissu ou un groupe de tissus particuliers. Le Système de Recombinaison Cre-LoxP (Nagy, 2000) est une technique qui permet une délétion, inversion ou translocation contrôlée dans l’espace et le temps. Elle est donc employée pour générer des lignées d’animaux présentant des KO tissu-spécifiques ou inductibles chimiquement en temps voulu et en observer les effets. Elle est notamment utilisée pour étudier la différenciation cellulaire (Dor et al, 2004) ou le rôle de protéines identifiées comme facteurs de risque pour des pathologies (Fujioka et al, 2011).
Principe
La Recombinaison Cre-LoxP tire son nom de l’enzyme Cre Recombinase dérivée du Bactériophage P1 et qui a pour fonction d’exciser un fragment d’ADN situé entre 2 séquences LoxP. Grâce à l’asymétrie de la séquence LoxP, l’enzyme peut soit catalyser la délétion, l’inversion ou la translocation de la séquence ciblée :
Figure 1 : Action de la Cre Recombinase selon la position des séquences LoxP
Le « floxing » (de l’anglais flanked by LoxP) se réalise avec CRISPR-Cas9 auquel la séquence LoxP. Une fois les séquences d’intérêt floxées, la Cre Recombinase dans les cellules de 3 façons :
-l’introduire dans les cellules à l’aide d’un virus ;
-insérer le gène de la Cre Recombinase sous contrôle du promoteur d’un gène dont l’expression dans la cellule cible ;
-insérer un gène de Cre Recombinase ligand-dépendante (souvent un récepteur œstrogène sensible au tamoxifène) sous contrôle d’un promoteur non-spécifique (house-keeping gene).
Mode opératoire
Les lignées générées sont de type Flox-Flox XXX Cre (ou FFXXXCre) où XXX
est le gène dont le promoteur est utilisé pour faire exprimer la Cre
Recombinase. La Cre Recombinase sera donc exprimée dans les cellules ciblées et
délètera, inversera ou transloquera le gène floxé. Il est également possible
d’induire l’expression de Cre Recombinase par un stimulus chimique induisant la
transcription du gène.
Présentation des résultats
Figure 2 : Délétion
tissu-spécifique d’un allèle floxé par co-expression de Cre-Recombinase (MGI,
Jax)
Interprétation des résultats
Le succès de l’opération peut être quantifié par PCR :
-pour vérifier une délétion, l’amorce utilisée est complémentaire de la séquence que constituent les deux parties précédemment autour de la séquence d’intérêt et maintenant liées
-pour une inversion ou translocation, utilise complémentaire de la séquence que forme la séquence d’intérêt avec la séquence qui entoure dans son nouveau locus.
En cas de succès, l’hybridation est possible et la polymérisation a lieu. es échantillons sur Southern Blot déterminer le génotype des individus et le succès de la méthode.
Intérêts et limites
Cette méthode permet d’étudier l’influence de mutations inactivant des protéines et est du coup très utilisée dans l’étude de pathologies, notamment quand le facteur de risque identifié est exprimé seulement dans un certain type cellulaire. Cependant, cette méthode nécessite de connaître ou identifier un promoteur strictement tissu-spécifique. De plus, la création de lignées génétiquement modifiées avec des gènes supplémentaires est un processus coûteux en temps et argent.
Références bibliographiques
Nagy, A. (2000). Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2) 99-109
Dor, Y., Brown, J., Martinez, O., Melton, DA. (2004) Adult pancreatic b-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987) 41-46
Fujioka, M., Tokano, H., Fujioka, KS., Okano, H., Edge, ASB. (2011) Generating mouse models of degenerative diseases using Cre/lox-mediated in vivo mosaic cell ablation. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6) 2462-2469
