Le test de viabilité au MTT est une méthode colorimétrique permettant le comptage rapide des cellules vivantes. Il est ensuite possible d’effectuer un rapport avec le nombre de cellules mortes, ce qui apparaît utile notamment dans les tests de toxicité d’un produit, ou lorsqu’il s’agit de suivre l’évolution d’une population cellulaire.
II)Principe
Cette méthode repose sur l’utilisation du sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium). Ce sel contient un anneau de tétrazolium qui est réduit en formazan en présence de la succinate déshydrogénase mitochondriale, une enzyme de la chaîne respiratoire des mitochondries. (Tominaga et al., 2019) Cela forme alors un précipité de couleur violette. La teneur en précipité formée est alors proportionnelle à la quantité de mitochondries, et donc de cellules vivantes présentes (mais aussi à l’activité métabolique de chaque cellule). Il est ensuite possible de mesurer par spectrophotométrie la quantité relative de cellules vivantes et avec un métabolisme actif.
Figure 1 : Transformation du MTT en cristaux de formazan par les réductases présentent dans les mitochondries.
III)Mode opératoire
L’expérimentation est, pour la majorité des cas, réalisée sur une plaque à 96 puits. 1000 à 100 000 cellules par puits sont incubées pendant 6 à 48 heures avec le stimulus approprié. Par la suite, le milieu est retiré et les cellules sont lavées avec du PBS. Du MTT est ensuite ajouté au milieu jusqu’à une concentration finale de 0.5 mg/mL. Les cellules sont alors incubées pendant 3 à 4 heures à 37°C jusqu’à ce que des cristaux de formazan, violets et intracellulaires, soient visibles au microscope. Le MTT étant sensible à la lumière, il est alors conseillé de couvrir les milieux en incubation avec du papier aluminium. Une fois l’incubation réalisée, le MTT est retiré et du DMSO à 100% est ajouté. Il est alors nécessaire d’incuber à température ambiante ou à 37°C pendant 30 minutes à 2 heures, jusqu’à ce que les cellules soient lysées et que les cristaux violets soient dissous (Barnabe, 2017). Passé ce temps, il est alors possible de mesurer l’absorbance à 570 nanomètres.
IV)Présentation des résultats
Une fois la manipulation effectuée, une plaque de 96 puits est obtenue, avec des puits colorés selon un gradient allant du rose pâle (peu de cellules) au violet foncé pour les échantillons contenant une importante population cellulaire. Afin de réellement quantifier ces concentrations, il peut être nécessaire de réaliser une gamme d'étalonnage.
Figure 2 : Plaque de 96 puits obtenue suite au test de viabilité au MTT. L'augmentation du nombre de cellules entraîne une couleur violette plus présente.
L’absorbance de chaque puits est alors quantifiée au spectrophotomètre avec une longueur d’onde de 570 nm. C’est à cette longueur d’onde que l’absorbance apparaît maximale pour le formazan formé. Pour chaque puits, on obtient alors une valeur d’absorbance.
V)Interprétation des résultats
Les valeurs d'absorbance des échantillons d'essai doivent ensuite être divisées par celles du témoin et multipliées par 100 pour obtenir le pourcentage de viabilité ou de prolifération cellulaire. Des valeurs d'absorbance supérieures à celles du témoin indiquent une prolifération cellulaire, tandis que des valeurs inférieures suggèrent la mort cellulaire ou l'inhibition de la prolifération.
La formule du pourcentage de prolifération est la suivante (Barnabe, 2017) :
Par exemple, une valeur de 120 % indique que la croissance cellulaire est 20 % plus importante dans l’échantillon. A l’inverse, une valeur de 75% indique un développement cellulaire moins important de l'ordre de 25%
VI)Intérêts et limites
Le test MTT permet d’obtenir rapidement une quantification de cellules vivantes dans un échantillon et permet alors de calculer de manière aisée des effets cytotoxiques, ou de suivre l’évolution d’une population cellulaire.
Cependant, la sensibilité d'un test MTT est inférieure à celle des tests fluorescents ou luminescents, en particulier avec des cellules qui ne prolifèrent pas facilement ou avec des cellules à faible activité métabolique. De plus, certains composés chimiques interfèrent avec la réduction du MTT en formazan et ne sont donc pas facilement compatibles avec les essais MTT. Il s'agit notamment des polyphénols, de la vitamine A, de la coenzyme A et du DTT (dithiothréitol). Il convient également de noter que l'exposition au MTT et la formation de cristaux de formazan sont cytotoxiques et entraînent des modifications dommageables de la morphologie cellulaire. (Riss, 2014) Pour finir, il faut noter que la réduction du tétrazolium reflète le métabolisme cellulaire, et non le nombre de cellules.
L'alternative la plus fiable et la plus largement utilisée au test MTT est le test ATP, qui mesure l'ATP comme marqueur de cellules viables. Cependant, là aussi, c’est l’activité cellulaire qui est quantifié et non pas directement le nombre de cellules. (Riss, 2014)
Tominaga, H., Ishiyama, M., Ohseto, F., Sasamoto, K., Hamamoto, T., Suzuki, K., & Watanabe, M. (1999). A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Analytical Communications, 36(2), 47‑50.https://doi.org/10.1039/A809656B
