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Puces SNP

I. Objectifs

Le génotypage par puce SNP permet d’identifier les SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) entre membres d’une même espèce. En effet, ce polymorphisme de l'ADN dans lequel des chromosomes diffèrent sur un segment donné par une seule paire de bases, constitue la forme la plus abondante de variations génétiques dans le génome. Il représente plus de 90% de toutes les différences entre individus. Les puces SNP sont un type de DNA microarray, technique qui a été décrite pour la première fois par Schena et al. en 1995.

II. Principe

Il y a deux plateformes de SNP arrays qui sont actuellement majoritairement utilisées : Affymetrix et Illumina (Lindgren et al, 2011). La chimie sous-jacente diffère d'une plateforme à l'autre, mais les deux peuvent être utilisées pour identifier les SNPs. Les principes sont similaires. Des ADN simples brins fragmentés sont hybridés à des matrices contenant des centaines de milliers de sondes. Une intensité de signal associée à chaque sonde et à sa cible est alors produite après hybridation, permettant de déterminer le SNP associé (LaFramboise, 2009). Les SNPs étant conservés au cours de l’évolution, ils sont utilisés comme marqueurs dans les études d’associations (Genome Wide Association Studies). Ces études lient les changements phénotypiques aux variations de séquence. Elles permettent de déterminer les SNPs responsables de la susceptibilité à certaines maladies ou à certains caractères phénotypiques (Kim et al, 2009).

III. Mode opératoire

Pour les deux méthodes, les échantillons d’ADN sont préparés avant les dépôts sur les sondes. Après avoir vérifié que la qualité et la quantité étaient suffisantes, l’ADN est fragmenté par méthode enzymatique puis dénaturé.

• Affymetrix
  

Affymetrix est la première méthode de DNA microarray qui a été développée en 1995. Pour chaque SNP ciblé, 20 paires de sondes de 25 nucléotides sont déposées à un endroit précis sur une plaque en verre ou en silicium. Les deux sondes de la paire se différencient par une paire de bases : une sonde va porter le premier allèle, une autre va porter le deuxième allèle possible (Figure 1). Ces nucléotides cibles sont marqués à la biotine. L’ajout d’un complexe de streptavidine phycoérythrine (SAPE) et d'anticorps IgG antistreptavidine biotinylée permettra de générer des intensités de couleurs. La position du SNP varie selon les sondes (Lam et al, 2010).

L’ADN va venir s’hybrider aux sondes complémentaires (deux allèles possibles au niveau du SNP). Cette hybridation est plus ou moins efficace : si l’ADN est complémentaire à la sonde sur 25 de ses bases, l’intensité sera forte (Figure 2). Au contraire, si l’ADN est complémentaire à sa sonde que sur 24 bases, l’intensité sera réduite.

Le scanner captera ensuite les données d’intensité de chaque marqueur SNP. La matrice SNP Affymetrix est fabriquée en utilisant les technologies de photolithographie où une image est transférée vers un substrat. Ces méthodes sophistiquées ont été empruntées au procédé de gravure des puces informatiques. Des dizaines à des centaines de milliers de sondes oligonucléotidiques différentes sont ainsi synthétisées sur un substrat en verre (Figure 3) (Lam et al, 2010).

• Illumina

Illumina est une méthode plus récente qui a été développée par Gunderson et al. en 2005. Chaque compartiment (carré vert sur la figure 4) contient l'ADN d'un individu. Des centaines de milliers de billes se trouvent dans chaque compartiment. Sur chaque bille de 3 µm de diamètre, les oligonucléotides accrochés, constitués de 50 nucléotides, sont spécifiques d’un SNP.

Les billes recouvertes de sondes sont réparties au hasard dans des micropuits recouvrant la surface du réseau, et chaque bille est présente en une vingtaine d'exemplaires sur chaque puce, afin d'assurer la réplication et la robustesse des résultats. Le caractère aléatoire de la position des billes minimise les effets des artefacts localisés dans l'espace. Ensuite, une procédure de décodage de l'emplacement des sondes est effectuée : les informations des séquence cibles de chaque type de bille sont décodées et traduites en coordonnées (X,Y) par un algorithme de Gunderson (Luo, 2007).

Les fragments d’ADN vont ensuite s'apparier avec leur séquence complémentaire. Puis les échantillons sont incubés avec de l'ADN polymérase et un mélange de nucléotides fluorescents : les bases A et T sont couplées au dinitrophényl (DNP) qui est reconnu par un anticorps anti-DNP fluorescent (Cy-5 rouge), et les bases C et G sont couplées à la biotine qui est reconnue par la streptavidine fluorescente (Cy-3 verte).

L'ADN polymérase étend les séquences de la sonde avec un nucléotide, complémentaire aux fragments d'ADN de l'individu, en position polymorphe.

 IV. Présentation des résultats

Voici, pour les deux méthodes, les images obtenues qui seront analysées.

IV) Interprétation des résultats

Pour la méthode Illumina, la couleur obtenue permet de déduire le génotype SNP de l'individu : AA (rouge), AC (jaune) ou CC (vert), pour un SNP A/G (Figure 8).

Pour la méthode Affymetrix, ce sont les différences d’intensités qui témoignent d’une complémentarité plus ou moins complète avec les sondes (Figure 7). Si l’appariement est total, on peut en déduire la version présente du SNP étudié.

V) Intérêts et limites

La technologie des puces de génotypage offre de nombreux avantages. En effet, l'ensemble du protocole est standardisé et automatisé (utilisation de kits et de robots), ce qui offre une grande robustesse et reproductibilité des résultats. De plus, la consommation d'ADN est faible (750 ng) pour la quantité de SNPs génotypés. En revanche, les puces restent sensibles à la qualité de l’ADN.

Les deux méthodes affichent des performances comparables (Tableau 1). Cependant, la plateforme Affymetrix est un peu plus chère (Luo, 2007) et présente une reproductibilité un peu supérieure à celle de la plateforme Illumina (Barnes, 2005) .

Tableau 1 : Comparaison des méthodes Affymetrix et Illumina

VI. Références bibliographiques

Barnes M. (2005). Microarray Platform Comparisons, Affymetrix White Paper

Gunderson, K., Steemers, F., Lee, G., Mendoza, L., and Chee, M. (2005). A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nature Genetics.

Kim, K.-K., Won, H.-H., Cho, S.S., Park, J.H., Kim, M.-J., Kim, S., and Kim, J.-W. (2009). Comparison of identical single nucleotide polymorphisms genotyped by the GeneChip Targeted Genotyping 25K, Affymetrix 500K and Illumina 550K platforms. Genomics 94, 89–93.

LaFramboise, T. (2009). Single nucleotide polymorphism arrays: a decade of biological, computational and technological advances. Nucleic Acids Res 37, 4181–4193.

Lam, C.-W., Lau, K.-C., and Tong, S.-F. (2010). Chapter 1 - Microarrays for Personalized Genomic Medicine. In Advances in Clinical Chemistry, G.S. Makowski, ed. (Elsevier), pp. 1–18.

Lindgren, D., Höglund, M., and Vallon-Christersson, J. (2011). Genotyping Techniques to Address Diversity in Tumors. In Advances in Cancer Research, D. Gisselsson, ed. (Academic Press), pp. 151–182.

Luo, T. (2007). Thèse : Comparison between Affymetrix and Illumina gene expression microarray platforms.

Schena, M., Shalon, D., Davis, R., and O. Brown, P. (1995). Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science.