L’objectif général est de sélectionner spécifiquement et de purifier un échantillon contenant plusieurs fragments d’ADN de différentes tailles. Il s’agit donc ici de récupérer un fragment d’ADN d’intérêt notamment en clonage, ligation, transfection et digestion.
Principe
Le principe général est directement lié à la différence de taille des fragments d’ADN. En effet, dans un gel d’agarose, les fragments d’ADN migrent différemment suivant leurs tailles. Cela permet, en découpant des morceaux de gel, de récupérer l’ADN d’intérêt. Deux gels sont généralement utilisés. Un gel de visionnage comportant une petite partie de l’échantillon permettant, d’une part de vérifier si la migration a eu lieu correctement, et d’autre part de limiter l’exposition aux UV, et un gel de coupage pour récolter l’échantillon. Il suffit ainsi de filtrer l’ADN par rapport aux morceaux de gel pour finalement récupérer l’ADN d’intérêt avec un bon taux de pureté.
Mode opératoire
Migration sur gel d’agarose
Cette partie regroupe les éléments pour constituer les gels d’agarose et y faire migrer l’ADN.
Deux types de gels vont être réalisés dont la taille est à adapter suivant le nombre d’échantillons. Le premier (dit gel de visionnage) contient 2 % d’agarose pour 100 ml de tampon TBE (Tris d'acide borique), soit 2 g d’agarose pour 100 ml de tampon (à adapter suivant le nombre d’échantillons). Le TBE permet une migration rapide de l’ADN, mais ce dernier s’y élue difficilement [1]. Le second (dit gel de coupage car c’est sur ce gel que l’on va récupérer les fragments d’ADN) contient 0.8 % d’agarose pour 100 ml de TAE (Tris Acétate EDTA). Ce tampon permet la bonne élution de l’ADN, mais impose une migration plus lente qu’avec le TBE [1]. Les mélanges sont chauffés au micro-ondes avec des agitations régulières jusqu’à ce que l’agarose soit dissout. Pour la révélation du gel, 1 μl de GelRedNucleic Acid Stain (ou du bromure d’éthidium) pour 100 ml est ajouté dans le mélange après dissolution de l’agarose.
Parallèlement à la préparation des gels, les cuves sont préparées en rajoutant du TAE ou du TBE, de telle sorte que les gels après formation soient recouverts par le tampon. Les échantillons sont préparés en rajoutant 1X de gel loadingdyepurple (6X) (ou 0,03 % de bleu de bromophénol - qui présente le désavantage de laisser une tâche sous UV-, c 0,03 % de xylène cyanol FF, 60 mM EDTA, pH 7,6, et 60 % de glycérol dans de l'eau de qualité biologie moléculaire [2], [3]).
10% du volume total de l’échantillon (rapport à varier suivant la masse présente dans l’échantillon) est chargé dans le gel de visionnage, le reste dans le gel de coupage. Les cuves d’électrophorèse sont soumises toutes deux à une tension constante de 80 V pendant 20 minutes, puis à 120 V pendant 40 minutes.
• Purification de l’ADN
Cette partie de la méthode se base le bioline-isolate II PCR and gel kit[4] que l’on peut remplacer par un mélange de phénol et de chloroforme[5]. Attention, le protocole peut être légèrement différent dans le cas d’une PCR (détails dans le kit).
Les fragments de gel contenant l’ADN sont récoltés et placés dans des tubes eppendorf de 1.5 ml. Afin de dissoudre le gel et fixer l’agarose, 200 μl du tampon de liaison CB (fourni par le kit) par 100 mg de gel sont ajouté dans le tube (note : si le gel contient >2 % d’agarose, le volume du tampon de liaison CB doit être doublé). Les échantillons sont incubés à 50 °C pendant 5-10 minutes, vortexés toutes les 2-3 minutes jusqu’à ce que le fragment de gel soit complètement dissout. Les échantillons sont transférés dans une colonne, elle-même placée dans un tube collecteur de 2 ml (fourni par le kit), et centrifugés à 17 000 g pendant 1 minute. 700 μl de tampon de nettoyage sont ajoutés dans la colonne (fourni dans le kit) et, après avoir changé les tubes collecteurs, les échantillons sont centrifugés à 17 000 g pendant 1 minute, pouvant être optionnellement lavés une seconde fois. Les échantillons sont enfin centrifugés à 17 000 g pendant 2 minutes pour éliminer les résidus d’éthanol.
Parallèlement, de l’eau pure est chauffée à 70 °C. Les colonnes sont placées dans des tubes eppendorf de 1.5 ml et 15-30 μl d’eau pure y sont ajoutés bien au centre de la colonne (ne pas utiliser le tampon donné dans le kit). Après une incubation à RT pendant une minute, les échantillons sont centrifugés à 17 000 g pendant 1 minute.
L’interprétation des résultats dépend d’une part des résultats du gel du visionnage. Néanmoins, une telle interprétation est bien souvent limitée, car la purification sur gel n’est pas une manipulation en vue d’obtenir des résultats à montrer dans une publication.
D’autre part, la purification de l’ADN collecté rentre en jeu. Rappel : l’ADN pur présente un ratio de DO 260/280 de 1.8 (plus ou moins 20%). Une valeur supérieure à 2 peut correspondre à une contamination par de l’ARN et une valeur inférieure à 1.6 peut correspondre à une contamination par des protéines ou par de l’éthanol ou du phénol. Le pH peut faire varier se ratio de 0.2-0.3.[6], [7]
Le premier intérêt de cette manipulation est de purifier efficacement un ADN d’intérêt vis-à-vis d’autres fragments. Cette technique trouve une application dans de nombreux domaines (cf partie objectif). L’utilisation du kit permet en outre de diminuer les coûts et de purifier des fragments de tailles très variées (50 bp à 20 kbp)[4]. D’autre part, le second intérêt de cette purification est qu’elle permet de vérifier la taille des fragments à récupérer et les résultats de l’expérimentation associée (comme dans le cas présenté précédemment).
Cependant, même si la purification est rapide avec le kit (20 minutes), elle devient rapidement longue avec les gels d’agarose. Outre la limite du kit en elle-même (taux de récupération : environ 10%), elle présente un autre désavantage vis-à-vis du GelRed. En effet, quand le GelRed est ajouté pendant la formation du gel, l’ADN va se lier à ce dernier pendant la migration, diminuant de ce fait sa distance de migration et augmentant sa taille. Il est donc conseillé pour pallier ce problème de marquer le gel au GelRed après sa formation. Néanmoins, cette opération demande une quantité plus importante en GelRed. Le bromure d’éthidium ne présente pas ce défaut, mais est mutagène [8]. Enfin, cette méthode se retrouve limitée par la différence de taille des fragments. En effet, si la différence est très petite, alors récolter précisément les fragments d’intérêt s’avère être difficile.
