Wiki des méthodes de biologie moléculaire et cellulaire

I) Objectifs

L’extraction de l’ARN au thiocyanate de guanidine a été mise en évidence en 1987 par les biochimistes Piotr Chomczynski et Nicoletta Sacchi [2], puis remise à jour en 2006 par ces mêmes chercheurs [3]. Cette technique est un procédé visant à isoler les ARN totaux d’un échantillon biologique, permettant par la suite l’étude de l’expression des gènes.

II) Principe

Les ARN totaux sont isolés par la réalisation d’une unique extraction entraînant une acidification du pH de la solution. Ceci permet un isolement des ARN dans une phase aqueuse supérieure, tandis que les ADN et protéines, moins solubles, se retrouvent dans l’interphase ou dans la phase organique inférieure [3]. Cette technique s’est imposée comme méthode de référence et est idéale pour une extraction rapide de plusieurs échantillons simultanément.

Afin d’apprécier la qualité des ARN obtenus, il est possible d'effectuer un dosage spectrophotométrique ainsi qu’une électrophorèse. Etant donné la fiabilité de la méthode, l’obtention d’échantillons purs est attendue. Les ARN totaux obtenus peuvent être utilisés dans le cadre de divers méthodes tel qu’une RT-PCR, un Northern Blot ou encore une hybridation.

III) Mode opératoire

La première étape consiste en la lyse des cellules ou tissus d’intérêts par le TRizol® constitué de thiocyanate de guanidine (agent dénaturant des protéines) et de phénol (solvant organique). Après homogénéisation des produits de la lyse, les ARN totaux sont purifiés par du chloroforme. Après centrifugation, ils se retrouvent alors dans la phase aqueuse supérieure (Figure 1). Une précipitation de ces ARN par de l’isopropanol est ensuite réalisée. En fin d’opération, les ARN sont souvent contaminés par le phénol. Ils peuvent être purifiés par une deuxième précipitation par de l’éthanol, qui devra lui-même être totalement éliminé, afin d’éviter des problèmes de bruits de fond. Enfin, l’ADN persistant est traité par de la DNase [6]. On obtient en fin de méthode des ARN totaux purifiés, exempts de tout solvant organique. Afin d’évaluer la quantité et le niveau de pureté des ARN extraits, des dosages spectrophotométriques à 230, 260 nm et 280 nm peuvent être réalisés, alors que la qualité de ces ARN est estimée par une électrophorèse [3].

Figure 1 : Observation des phases organique et aqueuse après extraction des ARN [5].

IV) Présentation des résultats

Les principaux résultats de cette méthode d'extraction sont donc des résultats de qualité, de quantité et de pureté, primordiaux pour assurer l’utilisation correcte des ARN par la suite (Figure 2). 

Figure 2 : Electrophorèse obtenue après l'extraction d’ARN de siliques d’Arabidopsis au TRIzol® en présence de quantité variable de DTT [4].

 

V) Interprétation des résultats

Les ARN sont considérés comme purs si, lors du dosage spectrophotométrique, les 2 rapports d’absorbance (A₂₆₀ / A₂₃₀) et (A₂₆₀ / A₂₈₀) sont proches de 2. Ces résultats seront confirmés par la réalisation d’une électrophorèse (Figure 2). Si l’on observe trois fortes bandes correspondant aux ARN ribosomiques 28S, 18S et 5S alors les ARN extraits sont purs.

VI) Intérêts et limites

Comparée aux autres méthodes d'extraction existantes, comme par exemple la méthode Chirgwin et al. [1] ou la méthode d’extraction sur colonne [6], l’extraction au phénol-chloroforme peut être caractérisée par sa fiabilité en termes de qualité des ARN totaux obtenus [4]. De plus, cette méthode est simple et rapide. En effet, elle nécessite une unique extraction et permet l’isolement simultané de plusieurs échantillons. Au contraire, l’ancienne méthode fortement utilisée, la méthode Chirgwin et al. [1], requiert de nombreuses ultracentrifugations et est plus longue [3]. Cependant, la méthode d’extraction au thiocyanate de guanidine reste plus lente que la méthode d’extraction sur colonne [6].

Références bibliographiques

[1] Chirgwin J. Przybyla A, MacDonald R., Rutter W. (1979). Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18 (24). 5294-5299.

 

[2] Chomczynski P., Sacchi N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162. 156-9.7

 

[3] Chomczynski P., Sacchi N. (2006). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on. Nature protocols. 1. 581-5. 

 

[4] Meng L., Feldman L. (2010). A rapid TRIzol-based two-step method for DNA-free RNA extraction from Arabidopsis siliques and dry seeds. Biotechnology journal. 5. 183-186.

 
[5] Suckale J. (2008). RNA extraction using trizol/tri.

https://openwetware.org/wiki/RNA_extraction_using_trizol/tri. Consulté le 13/03/2020.

 

[6] Tolosa J., Schjenken J., Civiti T., Clifton V., Smith R. (2007). Column-based method to simultaneously extract DNA, RNA, and proteins from the same sample. BioTechniques. 43 (3). 799-804.