Le test d’immunodiffusion double ou test d’Ouchterlony (1), a pour objectif la mise en évidence de la réaction anticorps (Ac) / antigène (Ag). Cette méthode expérimentale permet d’identifier un Ac spécifique à un Ag donné et inversement. Elle repose sur la formation d’un complexe visible à l’œil nu entre l’Ac et l’Ag (2).
Ce test peut être utilisé afin de détecter la présence d’Ac spécifique dans un sérum, ou encore afin d’identifier un Ag précis dans un liquide biologique. Cette méthode est purement qualitative.
Principe
Le principe du test d’Ouchterlony est basé sur 2 points fondamentaux :
La diffusion des molécules dans la gélose à partir de chaque puit.
La vitesse de diffusion dépend de la taille des molécules et de leur diversité dans chaque puit. Ce test requiert une double diffusion : celle de l’anticorps et celle de l’antigène.
La reconnaissance spécifique anticorps/antigène et le phénomène d'immunoprécipitation conduisant à la formation d’un complexe visible à l’œil nu
Ac et Ag diffusent donc dans la gélose dans toutes les directions depuis les puits. Quand les Ac et leur Ac spécifiques se rencontrent, ils forment un complexe immun (arc de précipitation) (3).
Mode opératoire
Préparation des boîtes :
De l’agarose (2) est coulée dans des boîtes de Pétri. Après refroidissement, des trous sont percés dans la gélose, grâce à un emporte-pièce. Ces trous sont régulièrement espacés (4).
Dépôts des substances :
A l’aide d’une pipette Pasteur, les différentes substances sont déposées dans les puits. L’échantillon à tester est mis dans le puit central et les puits périphériques contiennent les substances connues.
Si l’étude cherche à identifier un Ac alors les puits périphériques sont chargés en différents Ag. Inversement, si l’étude cherche à identifier un Ag, alors les puits périphériques sont chargés en différents Ac (4).
Marquage de la boîte :
Le nom des dépôts est marqué sur le couvercle de la boîte de Pétri. De plus, un trait est effectué entre la boîte et le couvercle au cas où celui-ci tourne.
La boîte est placée à l’étuve. La durée de mise à l’étuve est variable selon les études menées (4).
Présentation des résultats
Après la période de diffusion, les boîtes sont récupérées pour l’interprétation. La méthode d’Ouchterlony est une technique non quantitative, elle permet seulement d’identifier une interaction Ac/Ag. L’observateur détermine à l’œil nu la formation ou non d’un arc de précipitation (Figure 1). Pour interpréter les résultats, il suffit donc de noter entre quel(s) Ac et quel(s) Ag est apparu un arc de précipitation. Pour cela, l’observateur se réfère aux annotations précédentes prises sur le couvercle des boîtes.
Figure 1 : Illustration des deux types de situations attendues avec la méthode de la double immunodiffusion. (5). Entre le puit central et les puits périphériques, l’observateur identifie soit un arc de précipitation soit une absence d’arc. L'interprétation de l'expérience repose sur ces observations. Les produits utilisés sont des produits de substitutions « mimant » la réaction. Puits A, B, C : eau, puit D : soude, puit S : sulfate de zinc. (5)
Interprétation des résultats
L'observation d’arcs de précipitation permet d’identifier un Ag ou un Ac spécifique. En effet, les arcs de précipitation, ou complexes communs, sont le résultat de l’association d’un Ac à un Ag donné, et inversement (3). Ainsi, pour la figure 1, dans le cas où le puit central contient un Ag et les puits périphériques des Ac, la formation d’un arc entre le puit S et le puit D signifie que l’échantillon D contient des Ac spécifique à l’Ag S (Figure 2). Si le puit central contient un Ac et les puits périphériques des Ag, cela signifie que le puit D contient l’Ag correspondant à l’Ac S (Figure 2). Cette méthode permet donc l’identification soit d’Ac grâce à un Ag donné, soit un Ag grâce à des Ac connus.
Si aucun arc n’est observé entre deux puits, cela signifie qu’il n’y a pas eu de formation de complexe commun, donc pas de reconnaissance entre Ac et Ag. Les Ac et Ag mis en jeu ne sont donc pas spécifiques l’un de l’autre (Figure 2).
Figure 2 : Interprétation des résultats d’un test d’Ouchterlony
Intérêts et limites
La méthode d’Ouchterlony permet d’identifier rapidement et facilement une reconnaissance entre un Ac et un Ag. Cela peut être utile, par exemple, pour tester si des individus ont déjà été exposés à un Ag. En effet, si une exposition antérieure à déjà eu lieu, le sérum de l’individu va contenir des Ac spécifique à cet Ag.
Cette méthode a néanmoins ses limites. Il n’est pas possible avec cette méthode de quantifier la quantité d’Ac ou d’Ag dans les échantillons testés. De plus, la diffusion des molécules dans le gel d’agarose est dépendante, non seulement de la taille des molécules, mais aussi de la température et de la concentration des échantillons utilisés (6). Il n’est donc pas aisé de connaitre le temps nécessaire à la migration des molécules. Par conséquent, si la manipulation est réalisée dans de nouvelles conditions pour le manipulateur, il lui sera nécessaire de “surveiller” la formation d’arc au fur et à mesure du temps.
Références bibliographiques
Ouchterlony Ö(1958). Progress in Allergy.Chem Immunol Allergy. Kallós P (ed), Basel, Karger, vol 5, pp 1-78
