Wiki des méthodes de biologie moléculaire et cellulaire
Glossaire collaboratif des méthodes expérimentales de biologie moléculaire et cellulaire. Ce glossaire est réalisé par les étudiants du module "Méthodes expérimentales de biologie moléculaire et cellulaire" sous la supervision de l'équipe de Génétique Animale.
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| SB | Xenogreffe de cellules cancéreuses humaines chez un embryon de zebrafish à 48h post fécondation | ||
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Xénogreffe de cellules cancéreuses humaines sur un embryon de poisson zèbre à 48h post fécondation
I. Objectifs Les traitements anti-cancéreux sont nombreux, et leur variabilité inter-individu est forte. Un traitement optimal pour une tumeur sur un patient ne le sera pas sur un autre patient, ce qui entraîne souvent le test de plusieurs traitements lourds, avec beaucoup d’effets secondaires, pour peu d’efficacité. Une piste intéressante consiste à utiliser le poisson zèbre comme un avatar du patient. Des cellules issues de la tumeur du patient sont prélevées par biopsie, puis injectées à des embryons de poisson de 48 h, sur lesquels les traitements envisagés sont criblés. Il est alors possible de déterminer quel traitement est le plus efficace de façon personnalisée (figure 1).
Figure 1 : principe de l’utilisation de l’embryon de poisson zèbre comme avatar du patient : prélèvement des cellules cancéreuses issues de ce dernier, injection à un embryon de poisson de 48h, et criblage de l’efficacité des différents traitements. Pour atteindre cet objectif, la maîtrise de deux méthodes est nécessaire. Premièrement, il faut pouvoir cultiver les cellules issues de la tumeur du patient. Deuxièmement, il faut mettre au point la méthode d’injection de cellules tumorales dans un embryon de poisson-zèbre de 48 h, ainsi que le criblage des molécules sur ce modèle. Notre travail portera sur cette seconde méthode. II. Principe Des cellules tumorales de lignées immortalisées sont injectées dans des embryons de poisson zèbre de 48 h pour étudier l’effet de différentes molécules sur le développement tumoral et métastatique (hors gliome et leucémie) à 30h post injection. Des cellules humaines très métastatiques (exemple : MDA MB 231) sont donc utilisées. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour mettre en évidence des molécules avec un potentiel thérapeutique, ou pour acquérir une meilleure compréhension des mécanismes de développement tumoral et métastatique. (Vlecken and Bagowski, 2009). Les résultats attendus sont une modulation de la croissance tumorale et métastatique à 30h, en fonction de la molécule testée. III. Mode opératoire Préparation des cellules Les cellules sont marquées par fluorescence (calcéïne, lentivirus, …) et à 80% de confluence. Elles sont décollées au Versène, puis re suspendues dans 50µL de PBS coloré au rouge phénol. La xénogreffe Les embryons déchorionés sont placés sur un fond d’agarose dans des cuves à paraffine, puis de la tricaine (anesthésie) et de la méthylcellulose sont ajoutées, pour éviter que les embryons ne flottent trop. Le capillaire est "loadé" avec la solution de cellules cancéreuses, puis une dose est injectée à l’aide d’un FemtoJet à chaque embryon dans le canal de Cuvier (tronc veineux reliant la vascularisation du tronc et le cœur, zone d’injection privilégiée pour l’étude du développement métastatique). Une fois l’injection terminée, des images des tumeurs sont réalisées au microscope à fluorescence. Les embryons présentant des cellules ayant migré sont écartés (migration non métastatique). Pour les embryons restants, la molécule étudiée est ajoutée de façon exogène (dans l’eau). Ils sont ensuite placés à 33,5°C pendant un temps T de minimum 30h, temps auquel de nouvelles images sont réalisées : une de la tumeur (exposition courte) et une des métastases éventuelles (exposition longue). Pour chaque image de tumeur (à T0 et à T), la surface tumorale est mesurée grâce au logiciel Archimed (ou ImageJ). Le ratio surface tumorale à T/surface tumorale à T0 est calculé et le nombre de cellules qui ont migré pour chaque poisson à T sont comptées. IV. Présentation des résultats Les résultats peuvent prendre deux formes : nuage de points ou histogrammes. Dans les deux cas, ces graphes sont accompagnés d’images. De plus, un test statistique de Student est réalisé. Figure 2 : L’inhibition de LINC00152 réduit la prolifération et l’invasion des cellules du poumon dans les xénogreffes de poisson zèbre par stéréomicroscopie (Shen et al., 2020). Illustration d’une des façons de présenter les résultats obtenus pour la croissance tumorale avec la technique de xénogreffe de cellules cancéreuses chez l’embryon de poisson zèbre (nuage de points).
Figure
3 : Invasion,
dissémination et métastases des tumeurs T241-VEGF. Les longues flèches blanches
indiquent les tumeurs primaires, les courtes flèches blanches indiquent les
cellules métastatiques. (Lee et
al., 2009) Illustration de l’autre façon de présenter les résultats obtenus pour la croissance tumorale et le développement tumoral avec la technique de xénogreffe de cellules cancéreuses chez l’embryon de poisson zèbre (histogrammes). V) Interprétation des résultats Pour la croissance tumorale En comparant le ratio surface tumorale à T/surface tumorale à T0 du traitement étudié avec celui du contrôle, conclure sur l’effet de la molécule testée est possible. Un ratio supérieur à celui du contrôle indique que la molécule d’intérêt stimule la prolifération cellulaire et donc la croissance tumorale. Au contraire, un ratio inférieur à celui du contrôle traduit une inhibition totale ou partielle de cette croissance. Pour le développement métastatique Le principe de comparaison est le même, sauf qu’ici le nombre de cellules qui ont migré est étudié. Ainsi, la molécule d’intérêt peut stimuler ou inhiber la migration cellulaire in-vivo. V) Intérêts et limites Le principal modèle concurrent de celui-ci est le modèle murin. Ils présentent tous deux un développement de cancers spontanés et proches de ceux de l’homme (au niveau histologique et biochimique), et un objectif de médecine personnalisée. Cependant, cette méthode est très rapide et donc très utile lorsque de nombreuses molécules doivent être criblées. Pour obtenir des résultats, le modèle murin nécessite 2 à 6 mois, contre 2 à 3 jours pour le poisson. De plus, les traitements sont administrables en exogène, limitant le nombre d’injections. L’élevage de souris est cher, et leur injecter des cellules humaines nécessite l’absence de système immunitaire, ce qui entraîne de forts coûts (pièce stérile, …) et beaucoup de contraintes. L’élevage de poisson zèbre nécessite moins d’espace, et des coûts moindres. L’injection se réalisant sur des embryons de 48h, le système immunitaire est encore inexistant. Pour l’étude de la croissance tumorale, l’imagerie in-vivo est possible chez la souris, bien que plus coûteuse que chez le poisson. Cependant, pour l’étude du développement métastatique, la souris doit être sacrifiée, ce qui n’est pas le cas de l’embryon de poisson, qui est transparent. Cependant, le poisson zèbre a une température de croissance optimale de 28°C, tandis que celle de nos cellules est de 37°C. La croissance post-injection se réalise donc à 33°C, ce qui ralentit le métabolisme des cellules humaines et accélère celui du poisson. De plus, le poisson zèbre reste un modèle simplifié, et certains organes sont absents ou moins complexes. Enfin, ce modèle n’est pas pertinent pour l’étude de tous les cancers, notamment ceux liés au vieillissement (durée de vie courte de l’animal). VI) Références bibliographiques Vlecken DH, Bagowski CP. (2009). LIMK1 and LIMK2 are important for metastatic behavior and tumor cell-induced angiogenesis of pancreatic cancer cells. Zebrafish. 6(4):433-9.
Shen W, Pu J, Sun J, Tan B, Wang W, Wang L, Cheng J, Zuo Y. (2020). Zebrafish xenograft model of human lung cancer for studying the function of LINC00152 in cell proliferation and invasion. Cancer Cell International. 20(1), 376.
Lee SLC, Rouhi P, Dahl Jensen L, Zhang D, Ji H, Hauptmann G, Ingham P, Cao Y. (2009). Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(46), 19485‑19490.
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