3. 4 Les techniques analytiques
La méthode de référence de dénombrement des microorganismes dans les aliments repose sur la mise en culture en milieu liquide gélosé. Cependant, en raison de la lourdeur des expérimentations et du délai important pour obtenir les résultats (5 jours pour la détection des salmonelles et 3 jours pour la flore totale), des méthodes alternatives se sont développées, notamment grâce aux apports de la biologie moléculaire.
Le choix d'une technique dépend de nombreux critères dont les principaux sont :
- l'objectif de l'analyse, qui peut être de dénombrer ou simplement de détecter,
- l'urgence de l'analyse,
- le coût et l'externalisation des analyses,
- la validité de la méthode auprès des services de contrôle (méthode certifiée AFNOR, etc.).
Important
Malgré leur diversité, ces méthodes posent toutes des difficultés en matière d'échantillonnage et de récupération des microorganismes à partir de la matrice alimentaire considérée.
3. 4. 1 Les techniques de dénombrement
3. 4. 1. 1 Le dénombrement après culture : méthode classique (figure 159)
Figure 159 : Principe de la méthode classique de dénombrement après culture sur gélose
Echantillonnage
Il est nécessaire de se reporter à la Norme internationale spécifique du produit concerné. Si celle ci n'existe pas, les parties concernées devront convenir d'une stratégie en la matière. Dans le cas d'autocontrôles c'est à l'industriel de définir son plan de prélèvement et d'échantillonnage.
Transport et stockage avant analyse
Le transport des échantillons vers le laboratoire doit être réalisé dans des conditions évitant toute modification du nombre de microorganismes présents. Les températures de conservation dépendent des produits :
- produits secs ou stérilisés : température ambiante ;
- produits frais et réfrigérés : entre 0 et 4°C ;
- produits congelés ou surgelés : inférieure à -18°C ;
- produits pasteurisés et similaires : entre 0 et 4°C ;
Prise d'essai
La fraction prélevée pour l'analyse doit être aussi représentative que possible du produit analysé. Si l'aliment est composé de plusieurs éléments, chaque élément sera prélevé dans une proportion sensiblement équivalente à celle présente dans l'aliment. L'ensemble sera ensuite homogénéisé avant de prélever la fraction à analyser.
Lors du prélèvement, il convient de ne pas modifier la microflore du produit par un apport de microorganismes étrangers. Le prélèvement sera donc réalisé aseptiquement à proximité immédiate d'une flamme ou sous une hotte. Il représente une masse de 10 g ou 25 g (± 2%) selon les analyses.
Dénombrement
La méthode consiste à broyer l'aliment (en général 10 à 25 g au 1/10ème) dans un milieu tamponné, de manière à le dilacérer et à extraire les microorganismes de la matrice alimentaire. Le broyat est ensuite dilué de manière logarithmique dans le même diluant afin d'obtenir des solutions de moins en moins riches en microorganismes. Une fraction de chaque dilution (en général 1 ml ou 0,1 ml) est alors mélangée à un milieu de culture maintenu en surfusion dans une boîte de Pétri. Ce milieu peut éventuellement être sélectif vis à vis d'une catégorie de microorganisme.
Après solidification du milieu, les boîtes sont incubées dans des conditions (température, environnement gazeux, durée) permettant le développement optimum des microorganismes recherchés. Chaque cellule prisonnière du milieu gélosé se multiplie pour former au bout d'un certain temps une colonie visible à l'œil nu. Le comptage de ces colonies permet ainsi de dénombrer le nombre de microorganismes présents dans l'aliment avant broyage. Pour des raisons liées à la précision de la méthode de comptage, les dénombrements ne sont valables que s'ils sont effectués sur des boîtes comprenant de 30 à 300 colonies. L'aspect des colonies (forme, taille, couleur, etc.) peut donner une idée de la variété des microorganismes ; cependant, deux microorganismes très différents peuvent donner des colonies très semblables.
Important
Pour les dénombrements des microorganismes cultivés sur milieux sélectifs, il faut se conformer aux indications données par le fabricant. Cette méthode est très puissante, puisqu'elle permet de dénombrer sélectivement certains groupes microbiens parmi une flore complexe au seuil minimum de 10 microorganismes par gramme d'aliment.
Elle présente cependant certains inconvénients :
- c'est une méthode lourde au plan du matériel mis en œuvre (milieux de culture, boîtes de Pétri, pipettes) et des nombreuses manipulations (coût en main d'œuvre conséquent) ;
- le délai pour obtenir un résultat se compte en jour ;
- la précision est peu satisfaisante puisqu'on l'estime à 0,5 unités Log ;
- le nombre de microorganismes est parfois sous-estimé, car les cellules stressées par les opérations technologiques ou la composition physicochimique de l'aliment peuvent avoir des difficultés à se développer sur le milieu gélosé : on les appelle alors formes viables non cultivables (VNC) ;
- les espèces formant des chaînes ou des agrégats cellulaires conduisent à la formation de colonies par groupements, diminuant ainsi de façon sensible le nombre de microorganismes lors du dénombrement.
3. 4. 1. 2 Le dénombrement : méthodes alternatives
Afin de pallier ces inconvénients, plusieurs méthodes alternatives ont été développées. On peut distinguer celles qui s'inspirent de la méthode de dénombrement sur milieux de culture de celles utilisant des principes totalement différents.
Le pétrifilm
Le pétrifilm est composé de deux feuillets perméables et contient un milieu gélosé nutritif déshydraté qu'il suffit de réhydrater avant emploi : cette réhydratation se fait en même temps que le dépôt de la dilution. Après incubation, les colonies sont dénombrées.
Important
Cette technique présente l'avantage pour les entreprises disposant d'un laboratoire d'analyses sommaire de réduire le temps de préparation (milieux de culture). En revanche, elle est coûteuse et délicate au plan du comptage, car le développement des colonies est moins important que sur un milieu gélosé classique.
Le système SPIRAL (Gilchrist et al, 1977)
Cette technique permet d'automatiser la dilution de l'échantillon ainsi que son étalement sur un milieu gélosé. L'échantillon dilué est aspiré par l'appareil et étalé par un stylet en suivant un tracé en spirale et avec une dilution croissante du centre vers la périphérie.
Important
L'intérêt de cette technique est la précision du dénombrement, le gain de temps et de main d'œuvre et la possibilité d'automatiser le dénombrement des colonies par un système de lecture laser. Son inconvénient se situe au niveau du coût relativement élevé de l'appareil.