3. 4. 2 Le dénombrement : méthodes alternatives
La microméthode
Cette technique consiste à miniaturiser à l'aide de microplaques le dénombrement en milieu gélosé. Une pipette multi-canaux permet de diluer les échantillons à analyser de manière logarythmique dans des puits de microplques servant aux tests immunologiques. Une fraction des solutions sont ensuite déposées dans d'autres microplaques composées de puits un peu plus grands dans lesquels on dépose la gélose en surfusion avec la pipette multi-canaux. Les colonies sont ensuite comptées comme habituellement.
Cette méthode est très intéressante car elle permet d'augmenter considérablement la cadence d'analyse. Elle aussi beaucoup moins coûteuse que le dénombrement en boîtes de Pétri. Elle demande cependant des expérimentateurs précis et formés.
L'ATPmétrie (Stannard 1989)
Cette technique de dénombrement indirect est basée sur la mesure d'un des constituants cellulaires, l'adénosine tri phosphate (ATP). Cette molécule est présente dans tous les microorganismes et est dégradée rapidement à leur mort. La quantité d'ATP d'un échantillon est proportionnelle au nombre de bactéries présentes. La première étape du dosage consiste à lyser les cellules, ce qui permet la libération des molécules d'ATP dans le milieu ; on y ajoute une enzyme (luciférase) et son substrat (luciférine), qui en présence d'ATP émet de la lumière, dont l'intensité est proportionnelle à la quantité d'ATP. L'ATPmétrie ne permet pas de dénombrer sélectivement les micro-organismes mais donne une idée de l'importance de la flore totale.
Important
C'est la mesure idéale pour apprécier en temps réel l'efficacité du nettoyage et désinfection des surfaces avant la reprise de la production. Cette méthode est cependant peut précise par rapport au dénombrement classique.
La PCR en temps réel
La PCR (polymerase chain reaction) en temps réel, appelée aussi PCR quantitative, peut être utilisée pour détecter rapidement des microorganismes dans un aliment.
La PCR est une technique rapide d'amplification d'une séquence d'ADN donné double brin. En PCR quantitative, l'amplification de l'ADN se caractérise par une augmentation de la fluorescence se produisant dans le tube réactionnel et pouvant être mesurée par une cellule optique. Un gel d'électrophorèse, comme dans le cas de la PCR classique, n'est donc plus indispensable. Ce type de technique peut donc être utilisé assez facilement en laboratoire d'entreprise. La sensibilité de la technique est, suivant l'aliment, de 102 à 104 microorganismes par gramme. En effet, la facilité d'extraction des bactéries des matrices alimentaires est variable ; par exemple, la récupération des bactéries dans un milieu riche en matières grasses (fromage) est assez difficile tandis que celle effectuée dans un milieu riche en cellulose (salade) est beaucoup plus aisée.
Un des inconvénients de cette technique est de détecter indifféremment les cellules vivantes et les cellules mortes. Afin de cibler spécifiquement les cellules vivantes, une alternative consiste à détecter par PCR les molécules d'ARN qui ne sont présentes que dans ces cellules. La technique s'appelle alors la RT PCR (reverse transcriptase PCR).
Important
Pour des dénombrements d'une espèce spécifique, cette technique est bien adaptée puisqu'il suffit de sélectionner des amorces spécifiques à l'espèce. Lorsqu'il s'agit de dénombrer un groupe bactérien rassemblant plusieurs espèces, le problème est beaucoup plus complexe. En effet, il est très difficile de trouver une séquence spécifique d'un groupe bactérien regroupant des espèces différentes (par exemple, les entérobactéries ou la flore totale).