Le FRET est un processus par lequel de l’énergie d’un fluorophore donneur à l’état excité est transmis à fluorophore accepteur situé à proximité immédiate (distance <10nm). Cela permet donc de détecter les interactions intramoléculaires, telles qu’une interaction protéine/ protéine ou les changements de conformation. Il est alors possible de savoir où et quand, dans une cellule, des molécules d’intérêt interagissent.
II) Principe
Cette technique utilise deux molécules fluorescentes, chacune rattachée à une molécule d’étude (les deux fluorophores pouvant être sur la même molécule). L’un des deux est un fluorophore donneur et l’autre est accepteur. Le principe est d’exciter le fluorophore donneur. Lors de la lecture des résultats, si la fluorescence majoritaire correspond au donneur, c’est qu’il n’y a pas eu de transfert d’énergie et donc pas d’interaction. Inversement, si la fluorescence majoritaire vient du receveur, il y a eu un transfert d’énergie et donc une interaction entre les molécules étudiées. Il est aussi possible de ne mesurer que l’émission du donneur et le temps de celle-ci. Si le temps d’émission est cours, il y a interaction.
III) Mode opératoire
- La première étape de la méthode consiste à savoir quelle stratégie utiliser. La fluorescence peut être à l’état naturel dans la cellule ou alors être ajoutée de manière artificielle. Si le fluorophore est ajouté, celui-ci peut être lié à un constituant cellulaire d’étude, à un anticorps d’une molécule cible ou encore via l’ajout d’un ADNc codant pour un fluorophore à l’ADNc codant pour la protéine d’intérêt. En connaissant cela, il est alors possible de choisir une stratégie, soit utiliser deux protéines couplées aux fluorophores, soit une protéine et un anticorps ciblé contre une autre protéine, protéine et anticorps couplés à un fluorophore.
- Il faut ensuite définir la place de l’étiquette fluorescente, d’après les caractéristiques connues des protéines d’intérêt, telles que les propriétés biologiques, les données structurales.
- Un fois l’étiquette placée, il est nécessaire de tester l’ajout de celle-ci sur les propriétés des protéines d’intérêt, par rapport aux endogènes, comme la localisation subcellulaire ou les propriétés enzymatiques le cas échéant.
- Il est ensuite possible d’étudier la colocalisation des protéines d’intérêt, via la microscopie confocale, ou alors leurs interactions.
IV) Présentation des résultats
Selon le type d’analyse que l’utilisateur souhaite, les résultats peuvent se présenter sous plusieurs formes.
Si l’utilisateur souhaite voir la localisation d’interaction déjà connue, les résultats peuvent être présentés sous la forme de photographies prises au microscope à fluorescence. Les fluorescences peuvent correspondre au temps de vie du fluorophore donneur ou alors à la fluorescence du fluorophore accepteur.
L’utilisateur peut aussi chercher à montrer qu’il y a une interaction entre deux composants d’une cellule. Les résultats se présentent alors sous la forme de graphiques indiquant la durée de vie du fluorophore donneur.
V) Interprétation des résultats
Dans le cadre de la recherche d’interaction, la mesure de la durée de vie du fluorophore donneur se fait dans deux conditions. La première correspond au témoin, c’est-à-dire le fluorophore donneur seul et constitue donc une durée vie de référence. La seconde correspond aux conditions test, c’est-à-dire que les fluorophores accepteur et donneur sont présents dans la cellule. S’il y a interaction entre les molécules d’étude, l’émission du donneur sera absorbée par l’accepteur. La durée de vie du donneur sera alors diminuée par rapport au témoin.
Pour la localisation, l’utilisateur a juste besoin d’analyser les images issues de la microscopie, les points de fluorescence indiquent la localisation des molécules d’étude (intra-membranaire, cytoplasmique …) et l’intensité indique la proportion de molécules à ces endroits.
VI) Intérêts et limites
Cette technique a pour intérêt de savoir où et quand dans une cellule des molécules d’intérêt interagissent ; ce que d’autres techniques expérimentales ne permettent pas d’obtenir.
Par contre, dans cette technique, des résultats négatifs ne permettent pas d’affirmer que les molécules d’intérêt n’interagissent pas. De plus, cette technique suppose un niveau d’expression élevé des molécules d’intérêt, ce qui peut perturber leur fonction et/ ou la réponse cellulaire.
VII) Références bibliographiques
Clapp, Aaron R., Igor L. Medintz, and Hedi Mattoussi. 2006. “Förster Resonance Energy Transfer Investigations Using Quantum-Dot Fluorophores.” ChemPhysChem 7 (1): 47–57. doi:10.1002/cphc.200500217.
Clegg, Robert M. 1995. “Fluorescence Resonance Energy Transfer.” Current Opinion in Biotechnology 6 (1): 103–10. doi:10.1016/0958-1669(95)80016-6.
