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4. 2. 3 Les méthodes

La méthode de référence de dénombrement et de détection des microorganismes dans les aliments repose sur le dénombrement de cultures dans un milieu liquide gélosé. Cependant, en raison de la lourdeur des expérimentations et du délai important pour obtenir les résultats ( 5 jours pour la détection des salmonelles et 3 jours pour la flore totale, des méthodes alternatives de plus en plus orientées vers la biologie moléculaire se sont développées.

Le choix d'une technique dépendra de nombreux critères dont les principaux sont :

• le fait que l'on désire dénombrer ou simplement détecter,
• l'urgence de l'analyse,
• le coût et l'extériorisation des analyses,
• la validité de la méthode auprès des services de contrôle (méthode certifiée AFNOR ou non, .. ).  

Toutes ces méthodes nécessitent la mise en évidence des microorganismes présents dans l'aliment avec les problèmes de récupération des microorganismes à partir de la matrice alimentaire que cela pose.

- Le dénombrement après culture : méthode classique
Figure 2n Principe de la méthode classique de dénombrement après culture sur gélose

Echantillonnage

Pour chaque produit, il faut voir la Norme internationale spécifique du produit concerné. S'il n'y a pas de Norme, les parties concernées devront se mettre d'accord à ce sujet. Dans le cas d'autocontrôles c'est à l'industriel de définir son plan de prélèvement.

Transport et stockage avant analyse

Le transport des échantillons vers le laboratoire doit être réalisé dans des conditions évitant toute modification du nombre de microorganismes présents. Les températures de conservation dépendent des produits :

• produits stables : température ambiante
• produits frais et réfrigérés : entre 0 et 4°C
• produits congelés ou surgelés : inférieure à -18°C
• produits pasteurisés et similaires : entre 0 et 4°C

Prise d'essai

La fraction prélevée pour l'analyse doit être aussi représentative que possible du produit analysé. Si l'aliment est composé de plusieurs éléments, chaque élément sera prélevé dans une proportion sensiblement équivalente à celle qu'il représente dans l'aliment.

Lors du prélèvement, il faut avoir le souci de ne pas modifier la microflore du produit et en particulier de ne pas apporter de microorganismes étrangers. Le prélèvement sera donc réalisé aseptiquement à proximité immédiate d'une flamme ou sous une hotte. On pèsera aseptiquement 10 g ou 25 g (+ ou - 2%) selon les analyses.

Dénombrement

Cette méthode consiste à broyer l'aliment (en général au 1/10^ème) dans un milieu tamponné, de   manière à le dilacérer et à éjecter le plus possible de microorganismes de la matrice alimentaire. Le broyat est ensuite dilué de manière logarythmique dans le même diluant afin d'obtenir des solutions de moins en moins riches en microorganismes. Ensuite, une fraction de chaque dilution, en général 1ml ou 0.1 ml,   est mélangée dans une boîte de Pétri à un milieu de culture, sélectif ou non,   maintenu en surfusion. Après solidification de celui-ci, les boîtes sont incubées dans des conditions (température, atmosphère gazeuse, temps) permettant le développement optimum des microorganismes recherchés. Chaque cellule prisonnière dans le milieu gélosé se multipliera pour donner, au bout d'un ou plusieurs jours, une colonie visible à l'œil nu. Le comptage de ces colonies permet alors de dénombrer le nombre de microorganismes présents dans l'aliment avant broyage. Les dénombrements ne sont valables (pour des raisons liées à la précision de la méthode de comptage) que s'ils sont effectués sur des boîtes où il y a entre 30 et 300 colonies. On peut avoir une idée de la variété des microorganismes par la variété des colonies (forme, grosseur, couleur...), cependant, deux microorganismes très différents peuvent donner des colonies très ressemblantes.

Pour les dénombrements des microorganismes cultivés sur milieux sélectifs, il faut se fier aux indications données par le fabricant. Cette méthode est très puissante, puisqu'elle permet de dénombrer au minimum 10 microorganismes par gramme d'aliment et permet de dénombrer sélectivement certains groupes microbiens parmi une flore complexe.