- Le dénombrement : méthodes alternatives
Afin de pallier aux différents inconvénients énoncés plus haut (essentiellement liés à la lourdeur des expérimentations et aux délais importants pour obtenir un résultat), plusieurs méthodes alternatives ont été développées. On peut distinguer celles qui s'inspirent de la méthode de dénombrement sur milieux de culture et celles utilisant des principes totalement différents.
- Le Pétrifilm
Certains fabricants proposent des milieux gélosés déshydratés prêts à l'emploi, comme le Pétrifilm. Le pétrifilm est composé de deux feuillets perméables et contient un milieu nutritif déshydraté qu'il suffit de réhydrater avant emploi : cette réhydratation se fait en même temps que le dépôt de la dilution. Après incubation, les colonies sont dénombrées. Cette technique a l'avantage de réduire le temps de préparation du matériel (milieux de culture) et présentent un intérêt pour les entreprises ne disposant que d'un sommaire laboratoire d'analyses. Elle présente, en revanche, le désavantage d'être coûteuse et d'être délicate pour le comptage (le développement des colonies étant moins moins important que sur un milieu gélosé classique).
- Le système SPIRAL (Gilchrist et al., 1977)
Cette technique permet d'automatiser la dilution de l'échantillon ainsi que son étalement sur un milieu gélosé. L'échantillon dilué est aspiré par l'appareil et étalé par un stylet en suivant un tracé en spirale. Après incubation, la surface gélosée présente de moins en moins de colonies du centre vers la périphérie. L'intérêt de cette technique est la précision du dénombrement ainsi que le gain de temps et de main d'oeuvre. L'inconvénient est le coût relativement élevé de l'appareil. Un autre avantage est la possibilité d'automatiser le dénombrement des colonies par un système de lecture laser.
- L'ATPmétrie (Stannard 1989)
Il n'est plus question ici de cultiver des microrganismes afin de les compter mais de les dénombrer indirectement en mesurant un des constituants cellulaires : l'ATP. Cette molécule présente dans tous les microorganismes, est proportionelle à leur nombre et est dégradée rapidement à leur mort. La quantité d'ATP d'un échantillon contenant des bactéries sera donc proportionnelle au nombre de ces bactéries. Le principe de dosage est tout d'abord basé sur une lyse celullaire permettant la libération des molécules d'ATP dans le milieu. On ajoute ensuite une enzyme, la luciférase et son substrat, la luciférine. En présence d'ATP, la réaction enzymatique engendrée produit de la lumière, l'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité d'ATP, un luminomètre mesura cette intensité. L'ATPmétrie ne permet de dénombrer sélectivement les micro-organismes mais donne une idée de la contamination. La mesure est simple à faire, un laboratoire n'est pas nécessaire puisue tout peut être contenu dans une valise. C'est la mesure idéale pour apprécier rapidement (en temps réel) l'efficacité du nettoyage et désinfection des surfaces avant la reprise de la production. Cette méthode est cependant peut précise par rapport au dénombrement classique.
La PCR en temps réel
La PCR en temps réel, appelée aussi PCR quantitative, peut être utilisée pour détecter rapidement des microorganismes dans un aliment.
Dans cette technique, l'amplification de l'ADN se caractérise par une augmentation de la fluorescence se produisant dans le tube réactionnel et pouvant être mesurée par une cellule optique. Un gel d'électrophorèse, comme dans le cas de la PCR classique, n'est donc plus indispensable. Ce type de technique peut donc être utilisé assez facilement en laboratoire d'entreprise. La sensibilité de la technique est de 10² à 104 organismes par gramme d'aliment, suivant l'aliment. En effet, suivant les matrices alimentaires, les bactéries sont plus ou moins faciles à extraire. Par exemple, la récupération des bactéries dans un milieu riche en matières grasses comme un fromage est assez difficile tandis que celle effectuée dans un milieu riche en cellulose tel que la salade est beaucoup aisée.
Un des inconvénients de cette technique est qu'on détecte des cellules vivantes comme des cellules mortes. Afin de ne détecter que les cellules vivantes, une alternative consisterait à détecter par PCR les molécules d'ARN qui ne sont présentes que dans ces cellules. La technique s'appelle alors la RT PCR.
Cette technique peut être aussi utilisée pour détecter les microorganismes dans un échantillon. Lorsqu'il s'agit du dénombrement d'une espèce spécifique, cette technique est bien adaptée puisqu'en fait, il suffit de sélectionner des amorces spécifiques à l'espèce. Lorsqu'il s'agit de dénombrer un groupe bactérien rassemblant plusieurs espèces, le problème est beaucoup plus complexe. En effet, il est très délicat, voire quelquefois impossible, de trouver une séquence spécifique d'un groupe bactérien regroupant des espèces différentes, par exemple, les entérobactéries ou la flore totale.
Il existe aussi des méthodes biochimiques qui permettent d'apprécier de manière assez grossière la dégradation de certaines molécules de l'aliment. C'est l'exemple du dosage de l'azote basique volatil total, qui permet d'apprécier la dégradation des protéines, la mesure du degré de rancissement des matières grasses. Il existe aussi des méthodes physiques , comme la mesure de la tendreté et de la viscosité qui permettent aussi d'apprécier l'évolution de la structure de l'aliment lors de l'altération.