Extraction des lipides totaux et transformation en ester méthylique

en vue d’une analyse d’acide gras en chromatographie gazeuse

I)            I)  Objectifs

L’objectif de cette méthode est de permettre l’extraction et la transformation des lipides totaux d’un échantillon afin de réaliser une analyse d’acide gras en chromatographie en phase gazeuse. A partir d’un échantillon biologique quelconque (tissu, lysat cellulaire, …), cette méthode permet la séparation et l’extraction des lipides totaux et leur transformation en ester méthylique, afin d’analyser qualitativement et quantitativement la nature des constituants. Cette analyse se base sur l’utilisation d’un étalon interne.

II)          II)  Principe

Les lipides à extraire de l’échantillon doivent être séparés des autres constituants comme les glucides ou les protéines. Pour une séparation simple et rapide, on utilise une des propriétés physicochimiques des lipides : leur hydrophobie. Grâce à l’utilisation de solvants organiques tels que l’hexane, l’isopropanol ou le pentane, mis en contact avec l’échantillon, les lipides vont être extraits des autres constituants par la formation de deux phases. La phase organique, ici, la phase supérieure, contiendra les lipides totaux et la phase aqueuse contiendra le reste des constituants. 

Une fois les lipides isolés du mélange, des réactions chimiques de saponification, puis de méthylation vont être réalisées afin d’obtenir des esters méthyliques, qui sont facilement analysables en chromatographie gazeuse. 

Afin de pouvoir quantifier la nature des acides gras de l’échantillon, l’utilisation d’un standard interne absent de l’échantillon est nécessaire. Le standard couramment utilisé est un acide gras saturé impair : l’acide heptadécanoïque (C17:0) ou l’acide tridécanoïque (C13:0). 

III)        III) Mode opératoire

L’échantillon en solution (lysat cellulaire, broyat de tissu solubilisé, …) est ajouté dans un tube à méthylation à bouchon fermé. La première étape est l’ajout d’une quantité connue et précise du standard interne. La quantité de standard à ajouter est fonction de la quantité estimée de lipides dans l’échantillon. Pour une quantification plus précise, il est nécessaire d’avoir une quantité de standard interne qui est du même ordre de grandeur que les acides gras majoritaires présents dans l’échantillon.

Une acidification de la solution est réalisée en ajoutant 1 mL de solution d’HCL 3M.¹

Puis, 4 mL d’un mélange hexane / isopropanol (3:2 v/v) sont ajoutés. Une homogénéisation est nécessaire afin de bien séparer les constituants dans les phases. La solution est ensuite centrifugée (1100 g, 10 min) et la phase supérieure organique est prélevée et transférée dans un nouveau tube de méthylation. Cette étape d’extraction est répétée sur la phase aqueuse avec 2 mL d’hexane / isopropanol pour récupérer les lipides résiduels n’ayant pas été extraits.

Un lavage est effectué en ajoutant 2 mL de solution NaCl (0,9 %, v/v) puis on centrifuge (3 min, 1100 g) et la phase organique est récoltée. Une évaporation pour éliminer totalement les solvants est effectuée (sous flux d’azote, ou sous vide). 

Ensuite, une étape de saponification est réalisée. 1 mL de NaOH 0,5M est ajouté avant la mise au bain-marie à 70°C pendant 20 min des échantillons. L’étape de méthylation passe par l’ajout d’1 mL de Boron trifluoride dans le méthanol (12 %, v/v). Une double extraction est de nouveau réalisée en utilisant 4 mL de NaCl (0,9 %, v/v) additionné de 4 mL de pentane. La phase organique est ensuite lavée avec 2 mL de NaCl (0,9%, v/v) et évaporée.

Les esters méthyliques obtenus sont solubilisés dans 150 µL d’hexane et peuvent être analysés en chromatographie gazeuse.

IV)        IV) Présentation des résultats

Les esters méthyliques sont analysés en chromatographie gazeuse, couplée à un spectrophotomètre de masse par exemple². On obtient un chromatogramme avec lequel on peut identifier et quantifier les acides gras de l’échantillon.

Figure 1 : Chromatogramme d’analyse de certains acides gras d’hépatocarninome humain, obtenu par chromatographie gazeuse. Chaque pic correspond à un acide gras, identifiés avec le spectre de masse (production personnelle).

V)           V) Interprétation des résultats

Les acides gras présents dans l’échantillon sont identifiés grâce à leur temps de rétention et leur spectre de masse. Une comparaison avec des molécules de références pour les identifier est possible grâce à l’utilisation d’une banque. Pour certains acides gras polyinsaturés peu communs, il est parfois nécessaire d’effectuer des dérivations pour identifier spécifiquement la position des insaturations^{3, 4}.

VI)        VI) Intérêts et limites

Cette extraction de lipides suivie d’une préparation d’analyse en chromatographie gazeuse par transformation en ester méthylique permet une analyse fine des constituants en acides gras de l’échantillon. De plus, elle est qualitative et quantitative via l’utilisation d’un standard. Cependant elle ne permet pas d’identifier spécifiquement les classes des lipides totaux (phospholipides, triglycérides, esters de cholestérol, acides gras non estérifiés). Pour cela, une séparation des lipides totaux en fonction des classes est nécessaire par séparation en chromatographie sur couche mince. 

VII)      VII) Références bibliographiques

1. Rioux, V., F. Pédrono, H. Blanchard, C. Duby, N. Boulier-Monthéan, L. Bernard, E. Beauchamp, D. Catheline, and P. Legrand (2013) “Trans-Vaccenate Is Δ13-Desaturated by FADS3 in Rodents.” Journal of Lipid Research 54 (12): 3438–52. 

2.   Rioux, V., B. Choque, H. Ezanno, C. Duby, D. Catheline, and P. Legrand (2015) “Influence of the Cis-9, Cis-12 and Cis-15 Double Bond Position in Octadecenoic Acid (18:1) Isomers on the Rat FADS2-Catalyzed Δ6-Desaturation.” Chemistry and Physics of Lipids 187 (April): 10–19. 

3. Guillou, H., V. Rioux, D. Catheline, J. N. Thibault, M. Bouriel, S. Jan, S. D’Andrea, and P. Legrand (2003) “Conversion of hexade- canoic acid to hexadecenoic acid by rat Delta 6-desaturase”. J. Lipid Res. 44: 450–454.

4. Christie, W. W., G. Dobson, and R. O. Adlof (2007). “A practical guide to the isolation, analysis and identification of conjugated linoleic acid. Lipids. 42: 1073–1084. 

I) Objectifs

L’extraction de l’ARN au thiocyanate de guanidine a été mise en évidence en 1987 par les biochimistes Piotr Chomczynski et Nicoletta Sacchi [2], puis remise à jour en 2006 par ces mêmes chercheurs [3]. Cette technique est un procédé visant à isoler les ARN totaux d’un échantillon biologique, permettant par la suite l’étude de l’expression des gènes.

II) Principe

Les ARN totaux sont isolés par la réalisation d’une unique extraction entraînant une acidification du pH de la solution. Ceci permet un isolement des ARN dans une phase aqueuse supérieure, tandis que les ADN et protéines, moins solubles, se retrouvent dans l’interphase ou dans la phase organique inférieure [3]. Cette technique s’est imposée comme méthode de référence et est idéale pour une extraction rapide de plusieurs échantillons simultanément.

Afin d’apprécier la qualité des ARN obtenus, il est possible d'effectuer un dosage spectrophotométrique ainsi qu’une électrophorèse. Etant donné la fiabilité de la méthode, l’obtention d’échantillons purs est attendue. Les ARN totaux obtenus peuvent être utilisés dans le cadre de divers méthodes tel qu’une RT-PCR, un Northern Blot ou encore une hybridation.

III) Mode opératoire

La première étape consiste en la lyse des cellules ou tissus d’intérêts par le TRizol® constitué de thiocyanate de guanidine (agent dénaturant des protéines) et de phénol (solvant organique). Après homogénéisation des produits de la lyse, les ARN totaux sont purifiés par du chloroforme. Après centrifugation, ils se retrouvent alors dans la phase aqueuse supérieure (Figure 1). Une précipitation de ces ARN par de l’isopropanol est ensuite réalisée. En fin d’opération, les ARN sont souvent contaminés par le phénol. Ils peuvent être purifiés par une deuxième précipitation par de l’éthanol, qui devra lui-même être totalement éliminé, afin d’éviter des problèmes de bruits de fond. Enfin, l’ADN persistant est traité par de la DNase [6]. On obtient en fin de méthode des ARN totaux purifiés, exempts de tout solvant organique. Afin d’évaluer la quantité et le niveau de pureté des ARN extraits, des dosages spectrophotométriques à 230, 260 nm et 280 nm peuvent être réalisés, alors que la qualité de ces ARN est estimée par une électrophorèse [3].

Figure 1 : Observation des phases organique et aqueuse après extraction des ARN [5].

IV) Présentation des résultats

Les principaux résultats de cette méthode d'extraction sont donc des résultats de qualité, de quantité et de pureté, primordiaux pour assurer l’utilisation correcte des ARN par la suite (Figure 2). 

Figure 2 : Electrophorèse obtenue après l'extraction d’ARN de siliques d’Arabidopsis au TRIzol® en présence de quantité variable de DTT [4].

V) Interprétation des résultats

Les ARN sont considérés comme purs si, lors du dosage spectrophotométrique, les 2 rapports d’absorbance (A₂₆₀ / A₂₃₀) et (A₂₆₀ / A₂₈₀) sont proches de 2. Ces résultats seront confirmés par la réalisation d’une électrophorèse (Figure 2). Si l’on observe trois fortes bandes correspondant aux ARN ribosomiques 28S, 18S et 5S alors les ARN extraits sont purs.

VI) Intérêts et limites

Comparée aux autres méthodes d'extraction existantes, comme par exemple la méthode Chirgwin et al. [1] ou la méthode d’extraction sur colonne [6], l’extraction au phénol-chloroforme peut être caractérisée par sa fiabilité en termes de qualité des ARN totaux obtenus [4]. De plus, cette méthode est simple et rapide. En effet, elle nécessite une unique extraction et permet l’isolement simultané de plusieurs échantillons. Au contraire, l’ancienne méthode fortement utilisée, la méthode Chirgwin et al. [1], requiert de nombreuses ultracentrifugations et est plus longue [3]. Cependant, la méthode d’extraction au thiocyanate de guanidine reste plus lente que la méthode d’extraction sur colonne [6].

Références bibliographiques

[1] Chirgwin J. Przybyla A, MacDonald R., Rutter W. (1979). Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18 (24). 5294-5299.

[2] Chomczynski P., Sacchi N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162. 156-9.7

[3] Chomczynski P., Sacchi N. (2006). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on. Nature protocols. 1. 581-5. 

[4] Meng L., Feldman L. (2010). A rapid TRIzol-based two-step method for DNA-free RNA extraction from Arabidopsis siliques and dry seeds. Biotechnology journal. 5. 183-186.

 
[5] Suckale J. (2008). RNA extraction using trizol/tri.

https://openwetware.org/wiki/RNA_extraction_using_trizol/tri. Consulté le 13/03/2020.

[6] Tolosa J., Schjenken J., Civiti T., Clifton V., Smith R. (2007). Column-based method to simultaneously extract DNA, RNA, and proteins from the same sample. BioTechniques. 43 (3). 799-804.