La détection
Figure 5 : Principe de différentes méthodes rapide de détection
- la détection immunologique : on produit des anticorps spécifiques qui vont se fixer aux antigènes des bactéries pour former le complexe antigène-anticorps qui pourra ensuite être visualisé.
- la détection par les sondes nucléiques : les sondes produites en connaissance du génome de la bactérie recherchée sont utilisées afin de détecter la présence du gène dans la bactérie.
- la détection par PCR : La PCR est une technique rapide d'amplification d'une séquence d'ADN donné double brin. Cette technique permet d'accroître la sensibilité d'un test de détection puisqu'elle permet à partir d'une faible quantité d'ADN d'en obtenir une plus importante pour entamer une détection. Les copies seront ensuite confirmées par une technique de visualisation.
- la détection enzymatique : la connaissance du système enzymatique des bactéries et de leur spécificité permet de détecter la présence de cette bactérie en utilisant le substrat spécifique associé.
La visualisation :
Cette dernière étape permet à l'analyste d'interpréter le résultat de la détection. Plusieurs approches sont possibles.
Figure 6 : Principe de différentes méthodes rapide de visualisation
- la visualisation colorimétrique : En fixant un enzyme (phosphatase alcaline ou peroxydase) à des sondes ou à des anticorps, puis en ajoutant le substrat correspondant (après détection) on peut provoquer un changement de couleur qui peut être détecté et dosé par spectrophotométrie : on pourra donc en déduire le niveau de présence de la bactérie.
- La visualisation par fluorescence : elle repose sur l'ajout d'une molécule fluorescente (fluoresceine) fixée à la sonde nucléique ou à l'anticorps. Sous une lumière UV, on détecte la fluorescence.
Les techniques de biologie moléculaire, contrairement aux techniques classiques de dénombrement ou d'isolement après culture en milieu gélosé, ont un seuil de détection plus élevé. C'est ainsi que les techniques immunologiques ne permettent de détecter les microorganismes que si l'échantillon étudié en contient au minimum que 104 ou 105 microorganismes par ml. Les techniques de PCR sont un peu plus puissantes puisque le seuil descend à 102 microorganismes par ml.
On comprend bien qu'elles peuvent être utilisées facilement lorsqu'on désire ne détecter les microorganismes qu'après un enrichissement (la solution d'enrichissement contient en général plus de 104 microorganismes par ml). Mais elles imparfaites lorsque l'on souhaite que la limite du dénombrement soit semblable à celle en milieu gélosé.(10 par gramme ou 1 par ml ).
De plus, certains aliments contiennent des molécules inhibitrices de la PCR qu'il est difficile d'éliminer. Enfin, la PCR ne détecte habituellement que l'ADN présent dans l'échantillon.
Cela implique que les cellules mortes seront quand mêmes comptabilisées ou détectées par cette méthode. Une alternative consiste à utiliser la RT PCR (reverse transcriptase PCR) où on détecte l'ARN en général présent uniquement dans les cellules vivantes, et non l'ADN.
Le choix entre techniques de dénombrement et/ou de détection et entre méthodes classiques et rapides dépend donc de différents critères.
Figure 7 : Choix des techniques classiques ou alternatives de dénombrement et de détection